转生长激素基因中华倒刺鲃的构建及其检测

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本实验用从斑点叉尾鮰(Ictalurus punctatus) cDNA文库克隆到的生长激素基因,与鲤鱼β肌蛋白启动子、大麻哈鱼生长激素基因的poly(A)终止信号序列等调控元件共同构建了表达重组质粒pFV2cfGHc。提取重组质粒,用精子载体法导入中华倒刺鲃(Sinibarbus Sinensis)(俗称青波)的受精卵中,经孵化培养成转基因成鱼。抽提423尾转基因实验鱼血总DNA,经PCR检测表明:斑点叉尾鮰生长激素基因已导入中华倒刺鲃基因组中,导入率为17.26%。同时通过RT-PCR技术检测阳性中华倒刺鲃中生长激素基因的表达情况。实验首先比较了四种不同的鱼类基因组DNA的提取方法(组织基因组DNA抽提试剂盒法,血液基因组DNA抽提试剂盒法,组织基因组DNA的手工提取法和血液基因组DNA的手工提取法),确定了血液基因组DNA的手工提取法为鱼类基因组DNA提取的最佳方法,并采用此方法提取本实验所需检测的423尾转基因中华倒刺鲃基因组总DNA。接着对检测基因导入的PCR反应条件进行优化,确定本实验最佳反应的条件(Mg2+浓度为1.5mmol/L,模板量为25ng,退火温度69℃),在最佳反应条件下,采用合成的引物对423尾实验鱼基因组DNA进行PCR反应,分析实验结果,其中有73尾出现阳性条带,证明斑点叉尾鮰生长激素基因已导入中华倒刺鲃基因组中,阳性率为17.26%。本实验采取异硫氰酸胍法和TRI REAGENT试剂盒法快速提取阳性中华倒刺鲃脑组织中的总RNA,所提取的RNA无DNA等污染物,并且其产量、纯度完全能满足基因表达研究的需要。通过引物设计软件Premier5.0设计出特异性引物,并利用RT-PCR技术,检测外源生长激素基因在阳性中华倒刺鲃中的表达情况。
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