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生理性的DNA磷硫酰化修饰（DNA phosphorothioations,PT）是指细菌DNA磷酸骨架上的一个非桥接氧原子被硫原子所取代,具有修饰频率低,立体选择性等特征。本研究主要针对磷硫酰化DNA的抗氧化功能和结构特性进行研究。这种“原位”DNA化学修饰赋予了硫修饰阳性细菌直接清除氧化剂的能力,从而增强了生物抗逆性的生物学功能。但是,在机制方面上仍有若干问题尚未解决:1,磷硫酰化修饰在细菌体内的比例很低（1/10001/10000）,细菌为什么选择低比例的修饰作为体内抗氧化的“武器”,如果将磷硫酰化修饰的质粒DNA置于体外溶液环境中,对双氧水等氧化剂的抵抗范围有多大?2,该磷硫酰化修饰和传统的含硫还原剂（半胱氨酸,还原型谷胱甘肽）相比,是否具有自身的优点?3,由于磷硫酰化修饰的DNA在双氧水氧化下,会生成氢磷酯,该物质可以使DNA链发生断裂,那么,这种副产物是否会对DNA造成损伤而失去了原有的保护作用。以往磷硫酰化修饰的二核苷位点检测方法主要是HPLC/MS或测序,但二者均破坏了DNA的结构,因此,开发一种开发了磷硫酰化修饰质粒检测的快速检测方法尤为重要。最后,磷硫酰化修饰DNA结构的理论计算很少,且已有研究难以涵盖整个四核苷构象空间,因此,我们通过理论方法对磷硫酰化修饰的构象进行了深入研究。全文内容主要包括四大部分:第一部分内容为磷硫酰化修饰DNA的抗氧化功能研究,首先,以磷硫酰化修饰的大肠杆菌作为研究对象,当细菌在H2O2的作用下,胞内的氧化环境发生改变,细菌启动一系列应答机制来抵抗氧化损伤,PT阳性的细菌对氧化剂的抵御要优于PT阴性细菌;其次,硫代磷酸酯化合物（PS）对羟基自由基有选择性,并且在该反应中,传统的还原剂在浓度较高时会促进氧化反应的发生;再次,氧化剂ABTS·+与H2O2均可以将磷硫酰化修饰二核苷GsA转化为正常二核苷GA,而氢磷酯型GHA只有在高浓度的双氧水中才会产生,通过量子化学计算发现,氢磷酯的形成依赖于H2O2的浓度。因此,由于硫代磷酸酯的特殊化学性质,PT阳性的大肠杆菌具有DNA分子内的抗氧化活性,通过有效清除羟基自由基减少氧化应激,降低细胞内ROS水平,为DNA提供了额外的保护。第二部分内容是通过纳米金介导的增强拉曼光谱对磷硫酰化修饰DNA进行检测。首先,我们通过拉曼光谱检测硫代磷酸酯阴离子、磷硫酰化修饰的二核苷以及质粒DNA,用偏最小二乘-判别分析法（PLS-DA）区分PT修饰位点的碱基组成。结果表明,在水溶液中,PS在603 cm-1和432 cm-1形成两个特征峰;Rp和Sp修饰后的最低能量构型选择不同,Rp构型倾向于形成（g-,anti）,Sp构型倾向于形成（anti,g-）,但两种构型的拉曼光谱无显著差别。通过偏最小二乘-判别分析,表明质粒DNA在磷硫酰化修饰后的差异谱和GsA-Rp（二核苷）的差异谱最接近,而与其他15种二核苷的差异具有统计学意义,这一点与实验吻合。因此,基于拉曼的方法,可以初步确定磷硫酰化的修饰位点的邻近二核苷序列。第三部分通过分子模拟的方法对磷硫酰化修饰后的结构特性进行分析,以往研究表明PT修饰的二核苷具有序列偏好性,然而,DNA结构可能受到四核苷酸的侧翼碱基序列的影响,比二核苷酸水平更复杂。因此,我们将256对Rp构象和正常DNA的ε和ζ的均值两两比较后发现,与正常DNA相比,Rp修饰后大多数四核苷中ε的均值减小,ζ的均值增加,导致BII的比例减少,当固定中心的二核苷碱基时,改变四核苷的侧翼序列,ε和ζ会发生明显变化。以往研究表明C8-H8O3’或C6-H6O3’形成的氢键数目对于维持BII构型具有重要作用,因此,为了进一步分析BII比例降低的原因,我们根据碱基的不同,对C8-H8O3’或C6-H6O3’形成的氢键进行度量,标准为O3’-H距离小于3.5?,结果表明,BII的降低与对应氢键数目的减少呈现正相关,而氢键作为一种弱相互作用,归其根本在于电荷的相互作用,磷硫酰化修饰后,O3’的NBO电子密度为-0.71 e,而正常DNA为-0.89 e,因此,氢键受体的电荷密度降低导致C8-H8O3’或C6-H6O3’无法形成,从而稳定BII的因素消失,磷硫酰化DNA大多处于BI状态,很难向BII转化,同时,我们发现在磷硫酰化修饰的对侧Click链的相应位点,BI减少,提示了构象补偿效应。进一步对DNA的大沟和小沟分析后发现,大沟的宽度增加,深度变浅,从而影响了磷硫酰化修饰DNA和蛋白的结合能力。第四部分通过分子模拟的方法对磷硫酰化修饰位点与甲基化酶相互作用方式进行研究,磷硫酰化修饰后,会造成该蛋白局部结构不稳定,Rise和Roll角的增加,碱基平面发生扭转,π-π相互作用减弱,导致甲基化酶和DNA相互作用的局部关键氨基酸和碱基的识别能力改变。其次,对DNA-甲基化酶复合物的结合自由能分析,范德瓦斯能量项中静电作用能量项提供了主要的驱动力,溶剂化自由能非极性部分的能量贡献很小,而溶剂化自由能极性部分的贡献（ΔGPB）贡献较大,且溶剂化能的排序为Rp>N>Sp。Rp修饰后,Arg137发生扭转,难以与碱基平面发生π-π相互作用,从而造成局部结构不稳定,因此,Rp修饰后,甲基化酶与DNA局部的结合方式改变,导致酶的活性降低,甲基化难以发生。本论文通过计算和实验相结合的方法,通过对抗氧化的研究,解释了磷硫酰化修饰抵抗氧化损伤的分子机制;通过拉曼增强光谱分析,开发了一种直接,简便的磷硫酰化修饰位点检测方法;通过分子动力学模拟,第一次提出了磷硫酰化修饰后BI增加的理论模型,并且分析了修饰后甲基化酶活性降低的机制,对后续的实验和理论研究具有指导意义。