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目的:建立脂肪细胞与肝细胞共培养模型,观察促分化成熟脂肪细胞对肝细胞脂肪变及水通道蛋白9(aquaporin9,AQP9)表达的影响,并探讨其可能的作用机制。方法:首先,培养人前体脂肪细胞并促分化至完全成熟,将Hep G2细胞分别与未促分化脂肪细胞及促分化成熟脂肪细胞共培养48h,分别标记为对照组及实验组。对共培养的Hep G2细胞进行油红O染色及细胞内甘油三酯(triglyceride,TG)含量检测,同时检测磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol 3-kinase,PI3K)-丝苏氨酸蛋白激酶(serine-threonine kinase,Akt)信号通路变化及AQP9 m RNA和蛋白水平变化情况。随后,实验组在共培养的同时加入100ng/ml PI3K-Akt通路激动剂重组人胰岛素样生长因子-1(insulin-like growth factor-1,IGF-1),标记为实验组+IGF-1组,WB验证PI3K-Akt通路的激活,同时q RT-PCR和WB检测AQP9的表达变化。其次,通过重组慢病毒转染技术将Hep G2细胞进行重组慢病毒LV-AQP9或空载体LV-PWPI转染,分别标记为Hep G2-AQP9组和Hep G2-PWPI组,激光共聚焦检测转染效率,q RT-PCR和WB检测病毒转染后AQP9表达水平的改变,随后将稳定过表达的Hep G2-AQP9细胞和空载Hep G2-PWPI细胞分别与促分化成熟脂肪细胞共培养48小时,分别标记为Hep G2-AQP9共培养组和Hep G2-PWPI共培养组,再进行油红O染色及细胞内甘油三酯含量的检测。最后,向Hep G2-AQP9共培养组中加入IGF-1,记为Hep G2-AQP9共培养+IGF-1组,进行油红O染色及细胞内甘油三酯含量的检测,同时WB验证PI3K-Akt信号通路激活及AQP9 m RNA和蛋白水平变化。结果:与对照组相比,实验组中胞内脂滴明显增多,且胞内甘油三酯含量显著升高(P=0.006),提示脂肪细胞共培养能够诱导Hep G2细胞发生脂肪变性。q RT-PCR和WB结果分别提示实验组中AQP9 m RNA和蛋白的表达水平均显著高于对照组(P值分别为0.005、0.000),而WB结果显示实验组中磷酸化Akt(phosphorylated-Akt,p-Akt)蛋白的表达水平明显低于对照组(P=0.000),总Akt蛋白变化不明显,p-Akt/总Akt较对照组显著降低(P=0.001),提示脂肪细胞共培养能够抑制Hep G2细胞PI3K-Akt信号通路并上调AQP9的表达水平。WB结果提示实验组+IGF-1组中p-Akt蛋白的表达水平明显高于实验组(P=0.007),总Akt蛋白变化不明显,p-Akt/总Akt较对照组显著升高(P=0.000),同时,q RT-PCR和WB结果提示实验组+IGF-1组中AQP9m RNA和蛋白的表达水平均显著低于实验组(P值分别为0.000、0.005),提示脂肪细胞共培养可能通过PI3K-Akt通路调节AQP9的表达水平。激光共聚焦结果显示转染率>90%,q RT-PCR和WB结果均提示Hep G2-AQP9组中AQP9的m RNA和蛋白表达显著高于Hep G2-PWPI组(P值分别为0.002、0.000),提示稳定过表达AQP9细胞株的成功构建。与Hep G2-PWPI共培养组、Hep G2-AQP9共培养+IGF-1组相比,Hep G2-AQP9共培养组中胞内脂滴明显增多,且胞内甘油三酯含量显著升高(P值均为0.005),提示AQP9表达增高可以促进脂肪细胞共培养的Hep G2发生脂肪变性。WB结果提示,与Hep G2-AQP9共培养组对比,Hep G2-AQP9共培养+IGF-1组中p-Akt蛋白的表达水平及p-Akt/总Akt均明显升高(P=0.000),而AQP9表达显著下调(P值分别为0.000、0.001)。结论:脂肪细胞共培养可诱导Hep G2细胞发生脂肪变性,并可能通过抑制PI3K-Akt信号通路上调AQP9的表达参与Hep G2细胞的脂肪变性。