乳酸菌发酵谷物提取物对肿瘤细胞的抑制作用研究

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恶性肿瘤一直以来都是威胁人类健康和生命的主要疾病,如何预防肿瘤成为了我们面临的一个重大挑战。随着近年来食源性天然抗肿瘤物质的研究越来越多,更多的人把目光转移到了饮食防癌上。因此,筛选出更高效、安全的食源性抗肿瘤天然产物具有了重要的意义。我国大麦资源丰富、营养全面,富含多种生物活性组分,是谷物中的全价营养食物。利用微生物转化,能够更多、更有效地获得大麦中的抗肿瘤活性成分,为食源性天然抗肿瘤食品的开发提供试验依据,同时也能为我国大麦资源的高效利用提供新的思路。  本论文以大麦为原料,以乳酸菌为发酵菌株,筛选并制备乳酸菌发酵大麦提取物(LFBE),通过测定发酵过程中主要成分的变化探究LFBE抗肿瘤活性的物质基础,通过体外细胞试验研究LFBE对肿瘤细胞的抑制作用,并对其抗肿瘤机制进行初步探讨。主要研究内容和结果如下:  1.通过MTT法评价发酵提取物的抗肿瘤活性,筛选出最佳的发酵组合。结果表明:乳酸菌发酵大麦提取物抗肿瘤活性显著优于其它谷物发酵提取物,在2mg/mL时对肿瘤细胞的抑制率高达90.05%;从20株乳酸菌中筛选最适的发酵大麦菌株,初步选定已经过鉴定、菌株安全性更高的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum Dy-1)为发酵菌株,其半抑制浓度(IC50)为0.73mg/mL。  2.研究比较了乳酸菌发酵4种大麦过程中主要成分的变化。参照国标等方法测定了发酵过程中蛋白质、多酚、总糖的含量变化。结果表明:在0~48h发酵过程中,pH值逐渐降低,活菌数在12h达到最高值,4种LFBE的蛋白质含量先升后降,在36h达到峰值,多酚含量逐渐升高,总糖含量在12h达到最高值,随后逐渐降低;其中扬饲麦3号在发酵过程中的乳酸菌活菌数、蛋白质以及多酚含量均高于其它三种大麦,其在发酵后相对分子质量在25~40kDa的蛋白质含量有显著增加。故选择扬饲麦3号作进一步的细胞试验和分离纯化试验。  3.研究了LFBE对人结肠癌HT-29细胞的抑制作用。通过SDS-PAGE法观察发酵过程中蛋白质分子量的变化情况,采用CCK-8法和倒置荧光显微镜及扫描电镜观测细胞增殖能力与形态变化,通过Hoechst/PI双染法研究细胞凋亡,并利用单细胞凝胶电泳检测细胞的DNA损伤。结果表明:LFBE能够显著抑制肿瘤细胞的增殖,且具有时间-浓度依赖性。2mg/mL的LFBE分别处理细胞24 h、48 h、72 h后,其抑制率分别达到90.05%、93.34%和95.23%;LFBE能够破坏细胞正常形态和结构,使细胞皱缩变形,产生大量凋亡小体;同时LFBE的处理使得HT-29细胞阻滞于S期,细胞凋亡率显著增加,引起细胞DNA损伤严重,诱导细胞凋亡;LFBE可能是通过上调促凋亡因子Bax以及下调抗凋亡因子Bcl-2的表达促使细胞色素C释放,从而抑制HT-29细胞的生长。
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