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中华绒螯蟹(Eriocheir sinensis),不同地域对其称呼也有所不一样,常见的称呼有河蟹或者大闸蟹,有的地域称为清水蟹或者毛蟹。随着养殖强度、面积的不断扩大及水域环境的日趋恶化,中华绒螯蟹养殖过程中的病害问题愈来愈严重。其中“颤抖病”是制约我国中华绒螯蟹养殖产业可持续发展的主要瓶颈之一。前期研究证实一种螺原体(Spiroplasma eriocheiris)为中华绒螯蟹“颤抖病”的病原体,该病原通过鳃或体表进入蟹体内,侵染其靶细胞——血淋巴细胞,并通过血液的循环进而侵染各器官结缔组织,前期中华绒螯蟹感染螺原体后表现为无力、不食,后期病原大量侵染神经组织主要表现为附肢颤抖,直至死亡。因此,探究中华绒螯蟹的免疫防御机制,对减少该病原对中华绒螯蟹的损失具有十分重要的意义。本论文首先利用串联质谱标签(TMT)技术和液相色谱串联质谱(LC-MS/MS)技术,筛选出了螺原体侵染血淋巴细胞早期的差异表达蛋白;而后通过RACE技术扩增得到了中华绒螯蟹血管内皮生长因子受体(Vascular endothelial growth factor receptor,EsVEGFR)基因全长,并分析了其序列特征、表达模式;最后通过基因干扰等实验研究了EsVEGFR在螺原体侵染过程中的作用。本论文为明确螺原体的侵染机理以及中华绒螯蟹的防御机制奠定了良好的基础,本研究主要从以下三个方面展开:1.TMT(串联质谱标签)技术筛选螺原体感染前后中华绒螯蟹血淋巴细胞的差异蛋白通过TMT技术筛选螺原体感染中华绒螯蟹蟹血淋巴细胞早期(24 h)差异表达的蛋白,筛选出差异蛋白共212个,其中上调蛋白127个、下调蛋白85个,它们与细胞骨架、免疫、生理过程等相关,其中42个差异蛋白与免疫相关。上调蛋白包括组织蛋白酶L(cathepsin L)、谷胱甘肽s-转移酶(glutathione s-transferase,GST)、凝血因子B/B2(clotting factor B/B2)、黑化作用蛋白酶1(melanization protease 1)、丝氨酸蛋白酶抑制剂(serine protease inhibitor)、过氧化物酶1(peroxiredoxin 1,Prx1)等。下调蛋白包括铁蛋白2/3(ferritin2/3,Fer2/3)、凝集素(lectin)、脂多糖-1,3-葡聚糖结合蛋白(Lipopolysaccharides-1,3-glucan binding proteins,LGBP)、血管内皮生长因子受体蛋白1(Vascular endothelial growth factor receptor 1)、NADPH氧化酶5(NADPH oxidase 5,NOX5)、溶菌酶(lysozyme C)等。本文选择以上与免疫相关的8种蛋白,包括四种上调蛋白(cathepsin L、hemocytin、peroxiredoxin 1和NADPH oxidase 5)和四种下调蛋白(LGBP、ferritin2、Kazal-type protease inhibitor和VEGFR1),利用实时定量PCR检测这8种蛋白在基因水平上的变化,实验结果与TMT筛选结果保持一致。2.EsVEGFR1和EsVEGFR2基因克隆、信息学分析、组织表达和功能研究通过RACE技术扩增了中华绒螯蟹VEGFR基因的两个亚型EsVEGFR1和EsVEGFR2,EsVEGFR1 c DNA序列全长6470 bp,包含一个4380 bp的开放阅读框,编码1459个氨基酸的多肽,SMART网站预测EsVEGFR1蛋白的第802到第1261个氨基酸残基为一个Tyr Kc结构域。EsVEGFR2 c DNA序列全长5548bp,包含一个4704 bp的开放阅读框,编码1567个氨基酸的多肽,SMART网站预测第864到1259个氨基酸残基为一个Tyr Kc结构域。EsVEGFR的序列分析发现其蛋白序列与一些水生甲壳类的VEGFR的序列相似性达到99%,而与昆虫类以及其他无脊椎生物VEGFR序列的相似性也有60-80%。EsVEGFR1在神经组织中表达量最高,其他组织较少;EsVEGFR2在血淋巴细胞中表达量最高,其次是鳃,其他组织较少。中华绒螯蟹螺原体感染后EsVEGFR1在血淋巴细胞中的表达量在第1天下降,第3天和第5天有上升趋势,而后又呈现下调趋势。EsVEGFR2在第1天上升,第3天和第5天表达量下降,而后呈现上调趋势,说明EsVEGFR1和EsVEGFR2在螺原体侵染过程中起着重要的相互调节作用,这为进一步研究EsVEGFR的免疫功能奠定了基础。3.RNA干扰技术研究EsVEGFR1的功能利用人工转录合成的dsRNA将EsVEGFR1基因沉默,在注射dsRNA后使用qRT-PCR技术检测干扰效率,结果显示注射了EsVEGFR1特异性的dsRNA后该基因的转录水平与对照组(PBS、ds GFP)相比显著降低,这证明EsVEGFR1特异性dsRNA可显著降低血淋巴细胞中EsVEGFR1的转录水平。dsRNA将EsVEGFR1基因成功沉默后再用螺原体侵染中华绒螯蟹,结果显示血淋巴细胞中的螺原体拷贝数与对照组相比显著增多,同时中华绒螯蟹的死亡率与对照组(PBS+S.eriocheiris)相比,ds EsVEGFR1+S.eriocheiris组中中华绒螯蟹从第7 d开始死亡并且死亡率增加。这进一步说明沉默EsVEGFR1后降低了中华绒螯蟹的免疫力,促进了中华绒螯蟹螺原体对中华绒螯蟹的感染。总之,这些实验结果为更加深入了解中华绒螯蟹螺原体侵染中华绒螯蟹的机制奠定了一些理论基础,并且为实际应用中生产防治该病害的药物等提供一定的参考价值。