Pyoverdine合成酶编码基因对变形假单胞菌致病性的影响

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大黄鱼是海水鱼中养殖量最大的几个品种中的一种,是农业部评定的6种最佳出口水产品中的一种。伴随养殖的不断扩大,病害问题逐渐加剧并成为影响其健康发展的主要原因之一。“内脏白点病”是近几年最常见的病害之一。目前,变形假单胞菌(Pseudomonas plecoglossicida)是“内脏白点病”的病原菌的看法获得普遍的承认。“内脏白点病”具有非常显著的水温依赖性。  通过生物信息学和转录组高通量分析技术,分析12℃、18℃和28℃下培养的变形假单胞菌的转录组。对不同温度培养条件下变形假单胞菌的基因表达模式进行大规模筛查,获得了5种Pyoverdine(PVD)合成酶编码基因,发现其在致病温度(18℃)培养条件下的表达水平较非致病温度(12℃和28℃)培养条件下高得多。这意味着这5种PVD合成酶编码基因可能与变形假单胞菌的致病性相关联。由于PVD及其合成酶具有多变性以及物种特异性,且已有关于假单胞菌PVD的合成、分泌途径以及致病机制目前尚处于摸索阶段,许多具体的分子调控机制尚不明确,所以已有关于假单胞菌PVD的研究并不能填补变形假单胞菌PVD的研究空白。因此,深入了解变形假单胞菌PVD的合成、分泌途径,检验其与致病能力的关系,探索相关分子调控机制有重要意义。结合前期研究结果以及已有报道推测:PVD合成受温度变化调控可能是变形假单胞菌仅在特定温度下致病的重要诱因,而这5种PVD合成酶编码基因则是该调控机制的关键。  采用RT-PCR,检测12℃,18℃和28℃下培养变形假单胞菌的5个PVD合成酶编码基因的转录水平,与转录组测序的结果相印证,结果显示5个基因在18℃下的转录水平最高,与转录组测序结果一致。采用OD400光谱吸收法、OD630光谱吸收法、CAS平板检测法确认温度对变形假单胞菌PVD合成的影响。结果表明:18℃培养条件下PVD的合成量较12℃和28℃培养条件下多。  通过shRNA,成功构建5个PVD合成酶编码基因稳定沉默菌。通过RT-PCR对新构建的菌株中基因的转录情况进行检验。结果显示:新构建的菌株与野生株相比,基因转录程度显著降低,说明5个PVD合成酶编码基因稳定沉默菌构建成功。用OD400光谱吸收法,OD630光谱吸收法以及CAS平板检测法,检测基因沉默对变形假单胞菌PVD合成的影响。结合人工感染、功能和表型验证实验,验证这5个PVD合成酶编码基因对变形假单胞菌的铁摄取、生长、生物成膜和毒性的影响。结果显示5个PVD合成酶编码基因的沉默不仅减少变形假单胞菌PVD合成,使变形假单胞菌铁摄取、生长、生物成膜和毒性也减弱。
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