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CELO病毒(Chicken Embryo Lethal Orphan Virus)即鸡胚致死孤儿病毒,是目前进行病毒载体研究的主要工具之一。CELO病毒的基因组中fiber 1和fiber 2基因表达的两个纤突蛋白与该病毒的毒力和免疫原性相关。缺失fiber 1基因后病毒依然能复制,但失去野生型病毒特有的特异性转导作用。本试验就是利用这一特性构建了复制型重组CELO病毒载体,另外根据fiber 1的C端抗体结合区Knob-s区进行了原核表达。 根据GenBank(序列号U46933)中CELO病毒的基因组序列,利用Primer5.0设计一对特异性引物,以CELO病毒基因组DNA为模板。用PCR扩增出了长度3611bp的Fc片段(位于基因组序列的27150-30760bp,其中包括fiber 1全基因和侧翼序列),克隆到pMD18-T载体上,获得pT-Fc。利用双酶切位点XhoI处理pT-Fc;AfllI和Asel酶切处理pEGFP-N1得到增强式绿色荧光蛋白表达盒CMV-eGFP,将二者补平,然后连接得到转移质粒pTF-CMV-eGFP,与CELO病毒基因组DNA共转染293-T细胞,用转染产物感染CEF或CKC细胞,拯救重组病毒,最后通过荧光、PCR、电镜检测重组病毒。 根据GenBank中CELO病毒的fiber 1基因序列,选取了fiber 1蛋白的免疫优势区域,利用Primer 5.0设计一对特异性引物,以Fc为模板,扩增了其中807bp的目的片段(位于fiber 1的nt1554-2360),克隆入pGEX-6p-1载体中,转化大肠杆菌DH5α,然后用0.6mmol/L IPTG诱导外源基因的表达,获得54.6ku的目的蛋白;薄层扫描显示,重组蛋白占菌体总蛋白高达的35.7%;Western blot试验表明,目的蛋白具有较好的抗原活性。 本研究构建了CELO病毒载体系统,期望能在体内外基因治疗中发挥作用,并为今后禽类腺病毒载体疫苗的进一步研究奠定了基础。另外表达了fiber 1蛋白的免疫活性片段,可以为进一步建立CELO病毒的ELISA诊断方法,进行现地的血清学监测提供技术支撑。