第一部分子宫内膜蜕膜化过程中细胞因子表达谱的变化【研究目的】研究子宫内膜蜕膜化进程中多个细胞因子表达谱的变化以探讨对胚胎着床的影响。【材料和方法】1．取着床窗口期子宫内膜，0.25％胶原酶消化，过滤、贴壁提纯子宫内膜间质细胞（endometrial stromal cells，ESC）。采用波形蛋白抗体Vimentin免疫细胞化学法鉴定细胞纯度。计数1×10⁶个ESC，1ml无血清培养液培养48h后收集上清液。2．收集早孕蜕膜组织，0.25％胰酶—EDTA消化，Percoll梯度提纯蜕膜基质细胞（decidualized stromal cells，DSC）。并观察其在体外培养的生长特征。泌乳素（PRL）抗体免疫细胞化学法鉴定细胞纯度。计数1×10⁶个DSC，1ml无血清培养液培养48h后收集上清液。3．利用Luminex检测细胞培养上清液中15种细胞因子：TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-8、IL-10、IL-12、GM-CSF、G-CSF、MIP-1α、MCP-1、RANTES的浓度。比较这些细胞因子在着床窗口期子宫内膜与早孕期蜕膜细胞的变化。利用SPSS10.0软件进行统计学处理，独立样本t检验比较DSC组和ESC组之间因子表达量的差异，用Spearman相关分析因子表达量之间的相关性。P＜0.05差异有统计学意义。【结果】1．SABC法免疫细胞化学证实DSC的PRL抗体表达为阳性，细胞质内可见大量棕黄色颗粒；ESC的波形蛋白抗体表达为阳性，细胞质内可见大量棕黄色颗粒；实验所用的ESC和DSC纯度均在95％以上，且生物学特性得以维持。2．子宫内膜间质细胞分泌的上清液中，占优势的细胞因子的含量由高到低依次是IL-8、IL-6、IP-10、MCP-1、MIP-1α、TNF-α、GM-CSF、G-CSF。在DSC分泌的上清液中，占优势的细胞因子的含量由高到低依次是IL-8、MCP-1、IL-6、IP-10、GM-CSF、G-CSF、MIP-1a。上述因子可能在胚胎着床过程中发挥重要作用。3．蜕膜化后的DSC分泌细胞因子的表达谱与着床窗期的子宫内膜间质细胞分泌的因子表达谱相比，有明显的变化，其中TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、IP-10、GM-CSF、G-CSF、MIP-1α、RANTES含量减低，统计学上有显著性差异；DSC分泌IL-4的含量与ESC相比升高，也有显著性差异；MCP-1、IL-2、IL-12的表达在两者之间差异没有统计学意义。4．蜕膜化过程中，IL-1β与TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-10、GM-CSF、G-CSF、MIP-1α、RANTES之间存在明显正相关；IL-2与IL-12存在明显正相关：TNF-α与MCP-1存在明显正相关；TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-8、IL-10、GM-CSF、G-CSF、MIP-1α、RANTES、IP-10彼此之间两两成正相关。IL-4与TNF-α、IFN-γ、IL-1β、IL-6、IL-8、IL-10、GM-CSF、G-CSF、MIP-1α、RANTES之间存在明显负相关；TNF-α与IL-2之间存在明显负相关：MCP-1与IL-2、IL-12之间存在明显负相关。【结论】1．子宫内膜蜕膜化进程中多种细胞因子对于DSC的诱导和维持很重要，不同的因子作用各异，并且通过调控蜕膜化而影响胚胎着床。Th1型细胞细胞因子（IFN-γ、TNF-α）、趋化因子（IL-8、MCP-1、MIP-1α、RANTES、IP-10）、IL-1β、GM-CSF和G-CSF表达减低，表明母体面的免疫功能受到抑制，从而降低免疫排斥，有利于胚胎着床。Th2型细胞因子（IL-4）升高，起保护妊娠的的作用。2．Luminex液相蛋白芯片分析系统具有灵活性好、通量大、灵敏度高、信噪比好的特点，能同时检测到同一样本多个极微量的分子蛋白，比其它的检测方法具有更多优势。第二部分人早孕绒毛外滋养层细胞和蜕膜细胞共培养模型的建立【研究目的】建立可保持绒毛外细胞滋养层细胞与蜕膜基质细胞生物学特性的共培养细胞模型，应用于研究滋养细胞的侵袭行为。【材料和方法】1．按孕周收集人早孕绒毛组织，0.125％胰酶、DNA酶消化，过滤，BSA梯度沉降提纯绒毛外细胞滋养层细胞（extravillous cytotrophoblasts，EVCT）。细胞角蛋白CK7免疫细胞化学法、TGF-β₂免疫荧光染色法检测EVCT的纯度。2．蜕膜基质细胞的培养及鉴定同第一部分。3．计数6×10⁵个DSC放入微孔直径为8μm Transwell的下室，计数1×10⁵个EVCT放入5g／L Matrigel包被的Transwell上室孵育6h进行体外侵袭实验，观察EVCT的形态特征和在该共培养模型下滋养细胞的侵袭特性。【结果】1．SABC法免疫细胞化学证实EVCT的CK7抗体表达为阳性，细胞膜、细胞质内可见大量棕黄色颗粒；DSC的PRL抗体表达为阳性，细胞质内可见大量棕黄色颗粒。实验所用的EVCT和DSC纯度均在95％以上。2．细胞免疫荧光显示95％以上的EVCT表达TGFβ₂，在其细胞膜和细胞质中可观察到阳性表达的绿色荧光。Transwell上室中的EVCT保持了其侵袭能力，EVCT在Matrigel包被的滤膜中的侵袭指数为3.22±0.04。【结论】适当的培养方法可获得高纯度的EVCT细胞和DSC细胞，并使其维持特有的生物学活性，成功地建立了共培养系统模型，便于研究EVCT侵袭和胚胎着床的机制。第三部分滋养细胞侵入时的细胞因子表达谱的变化【研究目的】探讨早孕期绒毛外滋养细胞侵入到蜕膜细胞时母胎界面细胞因子表达谱的变化。【材料和方法】1．EVCT细胞和EVCT／DSC共培养系统体外培养方式同前。2．计数2×10⁵个EVCT放入微孔直径为0.4μm Transwell的上室，计数6×10⁵个DSC放入Transwell的下室，加入0.8ml无血清培养液在Transwell小室中培养48h后收集上清液。同样数目同批次的EVCT和DSC混合接种在24孔培养板，加入0.8ml无血清培养液培养48h后收集上清液。计数1×10⁶个EVCT单独种植在24孔培养板中，1ml无血清培养液培养48h后收集上清液。Luminex检测各组培养上清液中15种因子（同前）的浓度。滋养细胞／蜕膜细胞共培养组与单独蜕膜细胞组和单独滋养细胞组多重比较揭示了蜕膜细胞和滋养细胞间的相互影响。滋养细胞／蜕膜细胞共培养组之间按照在早孕时不同阶段（≤9周，＞9周）和共培养方式不同（Transwell和混合培养）互相比较反映了细胞因子表达的变化。Oneway—ANOVA、独立样本t检验和Spearman相关进行统计学分析。3．人早孕期绒毛外滋养细胞／蜕膜细胞共培养上清液中的细胞因子与单纯蜕膜细胞分泌的因子相比，许多因子发生了变化：其中【结果】1．在共培养的上清液中，占优势的细胞因子的含量由高到低依次是IL-6、IL-8、MCP-1、IP-10、MIP-1α、GM-CSF、G-CSF。在滋养细胞单独培养的上清液中，占优势的细胞因子的含量由高到低依次是IP-10、IL-6、MCP-1、G-CSF、IL-8、GM-CSF、RANTES。2．EVCT／DSC共培养后细胞分泌的因子表达谱与单独滋养细胞分泌的相比，IFN-γ、IL-6、IL-10、IL-12、IP-10、G-CSF、GM-CSF、MCP-1、RANTES含量下降，统计学上有显著性差异；IL-1β、MIP-1α、IL-4、TNF-α、IL-2、IL-8的表达在两者之间差别没有统计学意义。3．EVCT／DSC共培养后细胞分泌的因子表达谱与单独蜕膜细胞分泌的相比，IL-1β、IL-6、IFN-γ、MIP-1α、RANTES、IP-10水平升高，MCP-1、IL-4、IL-12水平降低，差异有统计学意义。IL-10、G-CSF、GM-CSF、TNF-α、IL-2、IL-8差异无统计学意义。4．滋养细胞和蜕膜细胞之间共同培养，有Transwell小室和混合培养两种方式，和用Transwell小室培养相比较，同样数目的滋养细胞和蜕膜细胞混合培养后分泌的细胞因子浓度降低的有：IL-6、IL-8、IL-10、G-CSF、MIP-1α、IP-10；而TNF-α、IFN-γ、RANTES、IL-1β、IL-2、IL-4、IL-12、MCP-1、GM-CSF不受影响。5．滋养细胞／蜕膜细胞分泌的因子表达量随妊娠周数的进展发生变化，其中下降的有TNF-α、IL-8、IFN-γ、G-CSF、MIP-1α上升的有RANTES；而IL-1β、IL-2、IL-4、IL-6、IL-12、IL-10、IP-10、MCP-1、GM-CSF变化不大。【结论】多种细胞因子在滋养细胞增殖、侵袭中起重要作用。在着床过程中IL-1β、MCP-1、RANTES、IL-6上调可以增强滋养细胞的侵袭能力，G-CSF、GM-CSF、IL-8、IP-10、MIP-1α显著下降抑制了NK细胞、巨噬细胞介导的免疫排斥反应。和蜕膜共培养可以降低IFN-γ、IL-2、IL-12、IL-6、IL-8、IL-10、IP-10、G-CSF、MIP-1α、MCP-1、RANTES的含量，减轻母体对胚胎的排斥，是妊娠成功的关键。第四部分米非司酮对着床过程中细胞因子表达谱的影响【研究目的】研究孕激素拮抗剂米非司酮（RU486）对早孕期滋养层细胞和蜕膜细胞分泌细胞因子的影响以探讨其终止早孕的分子机制。【材料和方法】1．EVCT细胞和EVCT／DSC共培养系统体外培养方式同前。2．同批来源的滋养细胞和滋养细胞／蜕膜细胞共培养系统分为2组，一组加入含1×10^-6mol／L的RU486的无血清培养液处理48h，一组为不含RU486的无血清培养基培养48h作为对照组，收集上清液。Luminex检测两组细胞培养上清液中15种因子（同前）的浓度。配对t检验比较各组之间因子表达量的差异，探讨RU486对母胎界面的细胞因子的影响。【结果】1．用米非司酮处理后，滋养细胞／蜕膜细胞共培养系统细胞因子表达降低的有：IL-4、IL-6、IL-10、GM-CSF、G-CSF、MIP-1α、RANTES、MCP-1；表达升高的有：TNF-α、IL-1β、IL-8、IL-12、IFN-γ；无影响的有：IL-2、IP-10。2．米非司酮处理单独培养的滋养细胞分泌的细胞因子发生变化：其中IL-2、IL-10、GM-CSF、G-CSF、MIP-1α表达下降；TNF-α、IL-1β、IFN-γ升高；IL-4、IL-6、IL-8、IL-12、MCP-1、RANTES、IP-10差异没有统计学意义。【结论】米非司酮通过影响母胎界面的细胞因子，促使Th1／Th2平衡作用向Th1方向偏移，增强对胚胎的排斥反应，诱发绒毛和蜕膜发育障碍，导致妊娠中止。