论文部分内容阅读
目的:观察沉默AGPS基因对神经胶质瘤长链非编码RNA(Long non-coding RNA,lnc RNA)谱系及信使RNA(messenger RNA,m RNA)谱系的影响,分析差异基因的功能和参与的信号通路及差异基因之间或信号通路之间相互作用关系,分析lnc RNA调控的m RNA及信号通路,预测其生物学功能并分析神经胶质瘤内在的发病机制。方法:将神经胶质瘤U251细胞分为sh R-AGPS-1组、sh R-AGPS-2组和阴性对照组,分别使用携带sh R-AGPS-1、sh R-AGPS-2或空载体慢病毒进行感染,筛选单克隆细胞进行增殖后观察细胞形态,评估感染后胶质瘤细胞株的体外生长情况;用Western blotting方法考察各组AGPS蛋白水平;应用基因芯片检测各组细胞lnc RNA和m RNA表达谱,筛选差异倍数大于1.2或者小于负1.2并且P值小于0.05的lnc RNAs和m RNAs作为差异基因;应用基因本体论(Gene Oncology,GO)数据库注释筛选得到的差异性表达m RNAs的功能,应用京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)数据库筛选差异性表达m RNAs参与的信号通路;根据差异m RNAs参与的显著差异通路间作用关系构建KEGG通路作用网络;根据具有差异性的基因间作用关系数据构建全局信号转导网络;通过差异性lnc RNAs和m RNAs之间共表达关系结果建立lnc RNA-m RNA的共表达网络;分析差异lnc RNAs和lnc RNAs的靶向m RNAs所富集的显著性信号通路的属性建立lnc RNA对通路的调控网络。结果:(1)慢病毒感染后的单克隆细胞株体外培养情况显示:与对照组比较,sh R-AGPS-1组和sh R-AGPS-2组细胞均出现团缩以及增殖抑制等变化,且sh R-AGPS-2组细胞异变更加明显;(2)蛋白免疫印迹结果表明sh R-AGPS-1组、sh R-AGPS-2组细胞AGPS蛋白相对表达量均较对照组显著降低(P<0.05);(3)差异基因筛选的结果表明,sh R-AGPS-1组与对照组比较共有180个lnc RNAs和110个m RNAs发生显著的差异表达,其中73个lnc RNAs和46个m RNAs表达上调、107个lnc RNAs和64个m RNAs表达下调(差异倍数|FC|>1.2,P<0.05);sh R-AGPS-2组与对照组比较共有499个lnc RNAs和531个m RNAs发生显著的差异表达,其中266个lnc RNAs和144个m RNAs表达上调、233个lnc RNAs和387个m RNAs表达下调(差异倍数|FC|>1.2,P<0.05);(4)GO分析结果显示差异表达的m RNAs主要富集到细胞对缺氧的反应、细胞外基质、蛋白激酶R样内质网激酶(protein kinase R-like endoplasmic reticulum kinase,PERK)介导的蛋白反应、细胞黏附、血管生成、免疫反应、机械刺激反应、血液凝固、白细胞游走、胚胎着床等功能;KEGG通路分析显示差异表达的m RNAs主要富集到晚期糖基化终末产物(advanced glycation end-product,AGE)及其受体(receptor for advanced glycation end-product,RAGE)信号通路、类风湿关节炎、肿瘤坏死因子(Tumor necrosis factor,TNF)信号通路、内质网蛋白加工、疟疾、低氧诱导因子1(hypoxia inducible factor1,HIF-1)信号通路、黏着斑、氨基酸合成、核因子k B(nuclear factor kappa-B,NF-k B)信号通路、哺乳动物类雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin,m TOR)信号通路等;(5)KEGG pathways间相互作用分析结果显示差异基因所富集的显著性的信号通路间相互联系,对疾病进行综合调控,其中以磷脂酰肌醇3激酶(phosphatidylinositol3kinase,PI3K)/丝氨酸苏氨酸激酶(AKT)信号通路、Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)信号通路、补体系统、黏着斑、血管内皮生长因子(Vascular endothelial growthfactor,VEGF)信号通路、HIF-1信号通路、m TOR信号通路、NF-k B信号通路、癌症中的蛋白多糖以及癌症中的碳代谢通路等最为重要;(6)基因全局信号转导结果显示,共有75个关键的m RNAs间相互作用,其中最核心的关键基因包括EGFR、ITGA11、IGF1R、AKT3、GYS1、PIK3CA、ENPP1、JUN、SDC4、CD44等;(7)lnc RNA-m RNA的共表达性分析结果表明,差异筛选的lnc RNAs、m RNAs中共有118个lnc RNAs与193个m RNAs之间有确定的共表达相关性,其中位于最重要的前10个关键调控作用的lnc RNAs为FENDRR、linc-ARHGAP11B-2、uc004cic.2、linc-TNFRSF9、RP11-221N13.3、linc＿luo＿1223、linc-NBPF15-1、NR＿044996＿4、RP11-760H22.2、uc001tkz.2;(8)lnc RNA对通路的调控作用分析结果表明处于网络核心的AK093732、LINC01384、FENDRR、uc011bsz.1、linc-PTPRN2等关键lnc RNAs对一些关键的信号通路例如细胞因子及细胞因子受体相互作用通路、PI3K-Akt信号通路、细胞黏附分子(cell adhesion molecules,CAMs)通路、AGE-RAGE信号通路、P53信号通路等进行调控,进而发挥对疾病调控作用。结论:(1)通路间相互作用分析和全局信号转导网络分析说明AGPS基因维持和促进胶质瘤细胞的生长和增殖能力与PI3K-Akt信号通路、Toll样受体信号通路、补体系统、黏着斑、VEGF通路等核心信号通路以及与EGFR、ITGA11、IGF1R、AKT3、GYS1、PIK3CA、ENPP1、JUN、SDC4、CD44等核心蛋白编码基因密切相关。(2)lnc RNA-m RNA共表达分析结果表明AGPS基因维持和促进胶质瘤细胞的生长和增殖能力受到FENDRR、linc-ARHGAP11B-2、uc004cic.2、linc-TNFRSF9、RP11-221N13.3、linc＿luo＿1223、linc-NBPF15-1、NR＿044996＿4、RP11-760H22.2、uc001tkz.2等核心lnc RNAs的调控。