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结核病是全球范围内严重危害人类健康的公共卫生问题之一。随着结核分枝杆菌分子耐药机制的深入研究,利用基因检测方法快速检测结核分枝杆菌及其耐药性对结核病的治疗具有重要的指导意义。但对于异质性耐药的检测,现有的分子方法还无法达到传统药敏试验定义1%耐药的判读标准。再者,近年来由非结核分枝杆菌感染引起的疾病逐渐增多,其临床症状与结核病相似,但两者的治疗方案不同。如何快速诊断非结核分枝杆菌病,并与结核病区分,对于分枝杆菌病的治疗尤为重要。因此,本论文围绕结核分枝杆菌异质性耐药的高灵敏检测和临床上常见分枝杆菌菌种鉴定展开了研究。第一章为绪论部分,首先简要介绍了全球结核病流行病学概况,耐药结核病的诊断和治疗,以及非结核分枝杆菌病概况和鉴定方法,然后介绍了熔解曲线分析的原理、特点,以及在耐药结核病检测中适用的荧光探针类型,最后提出了本论文的研究目的、研究内容和研究意义。第二章,以异烟肼为研究对象,我们建立一种基于熔解曲线分析的结核分枝杆菌异质性耐药的高灵敏检测方法,将其命名为DeepMelt。该方法利用双标记探针选择性地阻碍混合模板中野生型模板的扩增,从而富集了突变型模板。以katG S315T突变位点为例,单重DeepMelt体系能够在105copies/μL基因组模板中检出0.01%的突变部分。基于DeepMelt原理,我们建立了多重DeepMelt TB/INH体系,用以检测异烟肼耐药相关的katG 315密码子、inhA启动子和ahpC启动子突变。针对常见的四种突变位点,DeepMelt TB/INH体系均能够在104 copies/μL基因组模板中检出1%突变。然后,我们利用DeepMeltTB/INH体系检测了 602份临床分离株。以1%比例法药敏为金标准,与MeltProTB/INH试剂盒比较,DeepMelt TB/INH 体系的灵敏度由 93.6%(176/188,95%CI=89.2-96.3%)提高到 95.7%(170/188,95%CI=91.8-97.8%);在 109 份痰标本的检测中,DeepMelt TB/INH 体系的灵敏度则从 83.3%(20/24,95%CI=64.2-93.3%)提高到 91.7%(22/24,95%CI=74.2-97.7%)。在两批标本的检测中,特异性基本保持不变。同时,本研究利用Sanger测序和数字PCR方法验证了 20份异质性耐药标本,证明了 DeepMeltTB/INH体系具有高灵敏的异质性耐药检测能力。第三章,基于“荧光-熔点”二维标签,本章建立了一个单管四色的MeltPro Myco体系,实现了对临床上常见19种分枝杆菌的快速鉴定(3小时内)。在分析性能考察中,该体系能够准确鉴定51份分枝杆菌参考株至种/群的水平,并与16种非分枝杆菌无交叉反应。体系的最低检测限为300菌/mL,并且能够在混合感染中检出低至1%的少量菌种。最后,我们使用365份临床分离株来评价体系的临床诊断性能。结果表明MeltPro Myco体系检测19种分枝杆菌的灵敏度高于95.0%,且特异性高于99.0%。该方法简便快速、易于使用且鉴定结果准确,适用于临床常见分枝杆菌的鉴定。第四章,利用第三章所建立的MeltPro Myco体系检测了广州、厦门、河南、黑龙江和新疆等五个省市自治区共1163份临床分离株,初步调查了五个省市自治区的分枝杆菌菌种分布情况。结果显示,广州、厦门、河南、黑龙江和新疆等五个省市自治区的非结核分枝杆菌分离率分别为33.6%、4.2%、7.4%、0%和8.5%;而且,中国南部(广州和厦门)比中国中北部(河南、黑龙江和新疆)具有较高的非结核分枝杆菌分离率(135/567,23.8%vs 23/596,3.9%)和较多的非结核分枝杆菌种类(12 vs 2)。进一步地,我们利用MeltPro Myco体系检测了广州地区的94份涂片阳性痰样本,结果显示非结核分枝杆菌的检出率为25.5%。为了验证MeltPro Myco体系的检测结果,我们采用结核分枝杆菌复合群检测试剂盒、DNA测序或Spoligotyping等方法作为对照。结果显示,在1163份临床分离株和94份痰标本的检测中,该体系与对照方法的一致率分别是99.7%和100%。因此,本研究建立的分枝杆菌菌种鉴定体系可用于临床分离株和痰标本的检测,有望成为筛查非结核分枝杆菌的有力工具。