膀胱过度活动症（overactive bladder，OAB）是常见的膀胱功能障碍性疾病之一，临床表现为尿急、尿频甚至急迫性尿失禁等症状，使患者正常生活和身心健康受到极大影响，同时也使社会公共医疗系统的负担日益加重。正常膀胱在储尿期处于稳定的状态，而且由于良好的顺应性，在膀胱潴尿的早期都保持很低的腔内压，这些都有利于尿液从肾盂输尿管向膀胱的输送，以及避免出现尿液的膀胱－输尿管反流。这个过程非常复杂，是在神经、体液、心理意识以及自身等多种因素的调控下协调统一完成的。但是往往会有某种因素，使得这个统一协调的过程遭到破坏，使得膀胱逼尿肌出现了不受意识控制的收缩，伴发一系列尿急、尿频的临床表现，这些表现被统称为膀胱过度活动症，而膀胱自发性收缩则被称为逼尿肌过度活动（DO）是OAB的特征之一，在临床检查中，它可以被尿动力学检查所记录。OAB在欧美等发达的发病率很高，被称为10种最常见的慢性疾病之一；目前国内虽然没有大规模的临床流行病学研究报道其确切的发病率，然而就泌尿科就诊的病人数量来看，属于非常常见的疾病。OAB目前尚无理想的治疗办法，常用抗胆碱能药物由于副作用过大，限制了其临床应用，患者的大部分因副作用停止治疗，依从性很差。因此，迫切需要寻找新的有效的治疗靶点和替代疗法。关于OAB的发病机制已有大量文献进行报道。综合来看，OAB病因复杂，多种因素均参与致病，不同病因可能会导致OAB出现不同的发病机理，但确切的发病机制还远未明了。2011版《膀胱过度活动症诊断治疗指南》提出了四种可能的发病机制：①逼尿肌不稳定；②膀胱感觉过敏；③尿道及盆底肌功能异常；④其他原因。其中以逼尿肌不稳定最为常见，而逼尿肌不稳定最常继发于BOO性疾病，其中以BPH最为多见。尽管OAB病因复杂，但目前已有大量证据表明，继发于梗阻后的膀胱ICC细胞的数量改变和逼尿肌本身功能的改变在BOO所致OAB的发生中占有极为重要的地位。研究发现，逼尿肌细胞的兴奋收缩来源于其周围的ICC细胞，ICC细胞在对逼尿肌细胞自发性收缩起着非常关键的作用，近年来ICC细胞在膀胱生理和病理状态中的作用日益受到关注。在膀胱病理情况下，常常伴有膀胱间质细胞数目、分布或功能的异常，从而引起排尿障碍疾病。例如OAB患者及动物模型中膀胱间质细胞数量较正常组显著增高，抑制间质细胞的活性可减少OAB患者逼尿肌自发性电活动，且在动物实验中抑制间质细胞的活性还可改善豚鼠膀胱容量，提高膀胱顺应性，并减少膀胱充盈期的自发性活动。虽然有关膀胱ICC细胞兴奋性的研究处于初级阶段，但是胃肠道ICC细胞已被发现存在HCN通道。 HCN通道是目前研究最为清楚的一种电流起搏通道。它所引起的Ih电流在细胞兴奋起始过程中扮演了关键的角色，和多种细胞的兴奋性增加有关。因此我们猜想OAB膀胱中逼尿肌不自主收缩可能和OAB膀胱ICC细胞上HCN通道变化有关。HCN通道变化引发膀胱储尿期异常放电，导致膀胱异常收缩。而药物抑制间质细胞的活性可减少OAB患者逼尿肌自发性电活动，实际上是减少了ICC细胞上HCN通道表达。为此，我们以ICC细胞上的HCN通道为切入点，研究HCN通道在OAB发生过程中的作用及机制。本课题主要包括以下三部分：第一部分：HCN通道在人和大鼠膀胱分布和表达选用正常人膀胱组织和正常大鼠膀胱组织进行研究，采用组织免疫荧光和Western blot等方法来检测HCN1、2、3、4通道在人膀胱粘膜、粘膜下层、肌层和大鼠粘膜、粘膜下层、肌层的表达。在实验过程中，我们还无意中发现了vimentin和HCN4双标的肥大细胞。主要结果:1．人膀胱的免疫荧光检测结果表明：c-kit阳性ICC细胞在无论在人膀胱的粘膜下层和肌层都不多见，vimentin阳性ICC细胞广泛分布于人膀胱的粘膜下层和肌层。提示vimentin可以作为人膀胱ICC细胞的可靠标志物。2．人膀胱的免疫荧光检测结果表明：膀胱的ICC细胞主要分布于膀胱的粘膜下层和肌层。肌层中ICC细胞可以分布于肌膜周围，也可以分布在肌细胞间隙。3．人膀胱的免疫荧光检测结果表明：HCN4阳性ICC细胞分布于膀胱的粘膜下层和肌层中。粘膜下层HCN4阳性的ICC细胞可能和膀胱壁的信息传递有关，肌层中HCN4阳性的ICC细胞可能和膀胱自发性收缩有关。4．人膀胱的免疫荧光检测结果表明：粘膜下层还存在HCN4和vimentin双标阳性的肥大细胞，其作用可能和肥大细胞内细胞因子和活性物质的释放有关。5．大鼠膀胱的免疫荧光检测结果表明：c-kit阳性ICC细胞广泛分布于大鼠膀胱的粘膜下层和肌层。提示c-kit可以作为大鼠膀胱ICC细胞的可靠标志物。Vimentin和c-kit对人和大鼠染色结果不同可能和种属有关。6．大鼠膀胱的免疫荧光检测结果表明：HCN4阳性ICC细胞分布于膀胱的粘膜下层和肌层中。7．IPP软件的荧光强度检测后结果分析提示：无论是人还是大鼠粘膜下层HCN4通道表达明显高于其他亚型。8．Western blot检测后结果分析提示：无论是人还是大鼠肌层HCN4通道表达明显高于其他亚型。结论:1．HCN1、2、3、4通道在人和大鼠膀胱ICC细胞上都有表达。2．HCN4通道在人和大鼠膀胱ICC细胞上表达要高于其它亚型。3．人膀胱粘膜下层存在HCN4和vimentin双标阳性的肥大细胞。第二部分：HCN4通道OAB膀胱中分布和表达选用OAB大鼠模型中不同手术组（4周、6周、8周）进行对比研究，以正常大鼠膀胱组织作为对照。采用组织免疫荧光和Western blot方法来检测不同模型组中HCN4通道在粘膜下和肌层的表达变化。然后对各组中膀胱ICC细胞进行体外培养，利用细胞免疫荧光检测HCN4通道的分布变化。主要结果:1．大鼠OAB模型膀胱尿动力检测结果提示：自发性收缩频率在膀胱出口部分梗阻后明显增多，并且8周组明显高于其他组。2．OAB大鼠不同组的免疫荧光检测结果表明：ICC细胞在膀胱出口部分梗阻后明显增多，提示ICC细胞增多是OAB病理变化重要部分。3．OAB大鼠不同组的免疫荧光检测结果表明：HCN4通道在梗阻后明显增多，HCN4通道增多和ICC细胞增多存在正相关。4．IPP软件的组织荧光强度检测后统计结果分析提示：膀胱出口部分梗阻后粘膜下层ICC细胞和HCN4通道同时增加，并且8周组明显高于其他组。5．Western blot检测后统计结果分析提示：膀胱出口部分梗阻后肌层ICC细胞和HCN4通道同时增加，并且8周组明显高于其他组。提示HCN4通道增多和OAB自发性收缩频率呈正相关。6．IPP软件的细胞荧光强度检测后统计结果分析提示：同组织检测结果相似，膀胱出口部分梗阻后ICC细胞和HCN4通道同时增加，并且8周组明显高于其他组。结论:1．ICC细胞和HCN4通道在OAB模型中明显增多。2．HCN4通道增多和OAB自发性收缩频率呈正相关。第三部分：HCN4通道OAB发病过程中的机制研究选用OAB大鼠模型中不同手术组（4周、8周）的膀胱进行细胞培养，对各组中ICC细胞进行膜片钳检测，以正常大鼠膀胱ICC细胞作为对照。记录各组ICC细胞Ih电流改变情况。主要结果:1．正常逼尿肌细胞和ICC细胞膜片钳检测结果提示：逼尿肌上未记录到内向电流，ICC细胞可记录到Ih电流出现。提示ICC细胞极有可能是膀胱兴奋性起源细胞。2．OAB大鼠不同组的ICC细胞膜片钳检测结果提示：在OAB模型组，Ih电流密度明显增加，8周组明显高于其他组。HCN4通道增加和Ih电流密度呈正相关。3．OAB大鼠不同组的ICC细胞膜片钳检测结果提示：在OAB模型组，ICC细胞Ih电流密度增加，这可能是ICC细胞兴奋频率增加的原因。结论:1．ICC细胞可记录到Ih电流，其可能是膀胱的起搏细胞。2．OAB模型中ICC细胞的Ih电流密度明显高于正常。ICC细胞兴奋频率的增加可能是Ih电流密度增加引起的。主要结论一．HCN1、2、3、4通道在人和大鼠膀胱ICC细胞上都有表达。二．HCN4通道在人和大鼠膀胱ICC细胞上表达要高于其它亚型。三．ICC细胞和HCN4通道在OAB模型中明显增多。四．HCN4通道增多可能是导致OAB自发性收缩的原因之一。五．Ih电流密度增加可能是OAB自发性收缩频率增加的原因之一。