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背景:肝细胞癌（HCC）是较为常见的恶性肿瘤,是导致全球癌症死亡的第四大原因。我国作为世界肝癌大国,每年新增肝癌病例占全球新增总数的55%,且其死亡率占我国恶性肿瘤死亡率的第二位。目前,临床对于极早期肝癌患者（Barcelona Clinic Liver Cancer[BCLC]0/A）建议进行手术切除、肝移植术或局部消融术。然而无论采取何种治疗方式,肝癌复发都是治疗面临的一大难题。相关研究发现,肝癌复发通常发生在术后2年内（术后第一年复发率为19%–25%）,且术后5年复发率超过70%。肝癌的侵袭转移是导致肝癌术后患者高复发率和低生存率的主要原因。我科在数十年的临床实践中发现中药复方“解毒方”（Jiedu Fang,JDF）用于治疗多种肿瘤尤其是肝癌疗效显著,可抑制肝癌术后复发、延长肝癌患者生存期、提高患者生活质量,但最佳服药周期和具体作用机制还不清楚。通过前期回顾性研究和基因芯片筛选及变量生存分析发现,肝癌术后早期复发患者肝癌组织中Sec62表达高于未复发者,Sec62有望成为肝癌术后复发的独立预测因素之一。因此,本研究课题拟通过体内外研究,初步探讨JDF预防肝癌术后复发的最佳服药周期,进一步研究JDF是否通过调节Sec62预防肝癌术后复发,为中药防治肝癌术后复发提供一定实验基础。研究目的:1.通过动物实验初步探究中药复方JDF预防肝癌术后复发的最佳用药周期。2.明确JDF通过调控Sec62预防肝癌术后复发。研究方法:1.对肝癌术后模型裸鼠进行JDF灌胃干预,JDF预防肝癌术后复发的最佳用药时长。2.利用将肝癌术后模型裸鼠按照上述最佳用药时间进行JDF灌胃干预,将复发肝癌组织的Sec62蛋白表达进行定量分析,明确JDF预防肝癌复发与Sec62的关系。3.将不同浓度JDF分别作用于Sec62过表达的Huh7细胞(Huh7-Sec62OE)及其对照组,采用细胞划痕实验和Transwell实验,明确JDF通过Sec62抑制肝癌细胞的迁移侵袭功能。4.分别将Huh7细胞的Sec62进行敲降(Sec62KD)和过表达,利用细胞划痕实验、Transwell实验及MTT实验进一步观察Sec62在Huh7迁移、侵袭及增殖功能中的作用。5.采用人类基因表达谱芯片测序、IPA功能分析及GO分析进一步探究JDF通过下调Sec62预防肝癌术后复发的可能机制,并采用q RT-PCR、Western Blot、划痕实验、transwell实验、Co-IP对上述结果进行进一步的验证。结果:1.通过Luc-Huh7建立肝癌术后模型裸鼠,进行JDF干预,分别给药5天、10天、15天,连续观测复发情况,得到初步结论:JDF预防裸鼠肝癌术后复发的最佳给药周期是为10天。2.利用Luc-Huh7建立的肝癌术后模型裸鼠,JDF灌胃干预10天,复发肝癌组织Western Blot结果显示JDF组Sec62表达显著低于生理盐水组（P<0.05）。3.不同浓度JDF（0.2 mg/m L,0.5 mg/m L）分别作用于Huh7-Sec62OE和Huh7-NC细胞划痕实验和Transwell实验显示:JDF抑制Huh7细胞的迁移和侵袭能力,而当Huh7过表达Sec62时,JDF对于Huh7细胞的迁移和侵袭能力抑制作用显著减弱。4.采用Huh7-Sec62KD和Huh7-Sec62OE进行的细胞划痕实验、Transwell实验和MTT实验表明:过表达Sec62可促进Huh7的迁移和侵袭功能,而敲降Sec62则显著抑制Huh7的迁移和侵袭功能（P<0.01）,而二者在24 h对Huh7细胞增殖功能则没有明显影响。5.Huh7-Sec62KD vs.Huh7-NC和Huh7-Sec62KD vs.Huh7-NC人类基因表达谱芯片结果及IPA功能分析显示Sec62敲降和过表达的Huh7细胞中整合素（Integrin）信号转导的变化与Sec62的表达一致;GO差异基因功能富集显示其与细胞运动功能最相关。基于IPA数据库与Huh7-Sec62KD细胞微阵列数据对Integrin信号通路的整合分析和q RT-PCR及Western Blot验证结果证实:Sec62调控Integrin通路的成员包括Integrinα2b、Integrinα4、Integrinα5、IntegrinαV、CAV1、calpain、MLCK。进一步细胞验证结果表明:在Huh7-Sec62KD细胞过表达Integrinα2b、Integrinα4、Integrinα5和IntegrinαV,只有异位过表达Integrinα5或αV可消除敲降Sec62诱导的迁移抑制和侵袭抑制作用,且Huh7细胞Co-IP结果显示Sec62与IntegrinαV或Integrinα5直接结合,激活下游calpain、MLCK促进肝癌的侵袭转移。结论:1.JDF可以预防肝癌术后早期复发,且最佳用药周期为10天。2.JDF主要是通过下调Sec62/Integrinα/CAV1信号通路,抑制肝癌细胞迁移和侵袭功能,从而发挥预防肝癌术后复发的作用。