研究背景：长期以来，人们认为乙型肝炎病毒（HBV）被清除的标志是乙肝表面抗原（HBsAg）转阴，表面抗体（HBsAb）出现，实现HBsAg血清学转换。但随着HBVDNA检测技术灵敏度及特异性的不断提高，在一些HBsAg转阴和/或HBsAb出现的患者肝脏中，仍可检测出低水平的HBVDNA；临床也发现，一些HBsAb阳性，HBV-DNA阴性的白血病患者，在使用利妥昔单抗、苯丁酸氮芥及强的松龙的治疗过程中，又出现HBsAg转阳，HBV复制再活化，乙型肝炎复发。有学者认为，这一现象可能与肝细胞中病毒核酸或cccDNA难以被彻底清除有关，但具体机制尚不清楚。基于既往研究结果，我们推测这一现象可能与HBV感染特殊的靶细胞即感染肝干细胞有关。肝干细胞是未分化细胞，具有幼稚细胞特点，细胞质中缺乏细胞器，不具有成熟肝细胞功能，弱表达或不表达HLA-I类抗原，因而不能有效提呈抗原而能逃避免疫，可以成为病毒长期隐匿的场所。为明确HBV感染与肝干细胞的关系，进一步了解HBV能否感染并藏匿于肝干细胞中而不被清除，我们进行了以下相关研究。研究目的：本研究通过HBV感染肝干细胞和成肝细胞的体外试验，明确HBV能否感染肝干细胞和成肝细胞，肝干细胞和成肝细胞对HBV的易感性是否存在差异，HBV在不同分化程度细胞中的感染状态是否与病毒难以被完全清除相关。研究方法：我们采用HBV感染肝干细胞及成肝细胞的体外系统，利用间接免疫荧光、ELISA、RealTime PCR等手段，检测细胞内HBsAg，HBcAg，HBVDNA和cccDNA的表达情况，并在透射电镜下观察细胞中有无HBV颗粒产生。具体方法如下：体外分离和培养人胚胎肝脏中的肝干细胞和成肝细胞，用HBVDNA阳性血清进行感染。分别于感染后2，4，6，8天及感染后2，4，6，8，12，20，24天，收集成肝细胞和肝干细胞及其培养上清。以间接免疫荧光法检测细胞HBsAg和HBcAg表达；ELISA法检测细胞培养上清中HBsAg和HBeAg分泌情况；PCR法检测细胞中的HBVDNA及HBVcccDNA产生情况；透射电镜下观察细胞内病毒颗粒。分别以HepG2和A549细胞作为阳性对照和阴性对照。研究结果：成肝细胞于感染后2天开始表达HBsAg和HBcAg，PCR法可检测到细胞内HBVDNA，透射电镜观察到完整病毒颗粒。HBV感染肝干细胞后第2，4，6，8，12，16，20，24天，肝干细胞中均未检测到HBsAg及HBcAg，但感染后第4天开始细胞内有HBVDNA检出，透射电镜结果发现肝干细胞内质网中有病毒核壳体，未发现完整病毒颗粒。所有培养细胞中均未检测到cccDNA。结论：1.HBV能感染成肝细胞，病毒在细胞内能完成转录翻译装配的过程，能合成病毒抗原、核心颗粒及核壳体，并在细胞内装配形成完整病毒颗粒；2.HBV感染肝干细胞后，在细胞内以病毒核酸的形式存在，可以形成核壳体，但病毒核酸转录翻译存在缺陷，病毒抗原合成障碍，核壳体在内质网中不能组装成完整病毒颗粒；3.HBVcccDNA的形成需要一定的细胞微环境，体外培养无法完全模拟体内环境，推测体外培养细胞中HBVDNA无法形成共价闭合环状结构，这可能是HBV感染体外模型难以建立的重要原因；4.HBV感染肝干细胞后，不表达病毒抗原，病毒可以长期隐匿于细胞中，不被免疫系统识别并清除；随着肝干细胞分化为成肝细胞、成熟肝细胞，细胞结构和功能逐步完善，病毒复制可以再度活跃；因此，肝干细胞的感染是病毒难以清除的重要原因，可能与HBV感染慢性化、隐匿性感染及原发性肝癌的发生有关。