目的：　　 唾液酸是一种九碳糖酸,在真核细胞和原核细胞中唾液酸用于修饰细胞分子,通常位于糖结合物如糖蛋白,糖脂的末端,这些糖结合物在真核细胞表面,血清及唾液中普遍存在。有实验表明唾液酸与细菌的营养,细菌细胞结构的形成及细菌与细胞的相互作用有关。细菌利用的唾液酸的来源有两种:内源性合成和外源性分解。有些细菌本身有合成唾液酸的能力,通过自身代谢合成唾液酸,即内源性合成;而另一些细菌是通过唾液酸酶水解糖结合物最末端的残基从而获得唾液酸,即外源性分解。因此细菌编码的唾液酸酶及其在不同细菌中的功能倍受学者们的关注。　　 唾液酸酶是一种水解酶,可以选择性的水解糖结合物末端的残基,从而获得游离的唾液酸,唾液酸酶分两类:内切酶和外切酶,外切酶能够切割α-(2→8)键的唾液酸残基,外切酶能够切割α-(2→3),α-(2→6),α-(2→8)键的唾液酸残基。实验表明细菌的唾液酸酶可能与细菌的生长和毒性有关。Thompson等发现福赛氏坦纳菌唾液酸酶基因(NanH基因)参与唾液酸的代谢;Honma等发现福赛氏坦纳菌的NanH基因同样参与了福赛氏坦纳菌与上皮细胞的相互作用。此外,Banerjee等研究表明肺炎链球菌唾液酸酶与细菌的内化有关。Tong等研究发现肺炎链球菌唾液酸酶(NanA)突变株丧失了粘附的能力。由此可见,唾液酸酶在细菌的生存和致病过程中所起的作用不容忽视。　　 牙龈卟啉单胞菌(Porphyromonas gingivalis,P.gingivalis)是主要的牙周致病菌之一,包含很多毒力因子,如菌毛,蛋白酶等,这些毒力因子在P.gingivalis的粘附和致病过程中发挥了重要的作用。通过P.gingivalisW83全基因组序列我们发现PG0352是唾液酸酶的同源基因,推测PG0352在P.gingivalis中编码唾液酸酶基因,本实验的目的是通过构建PG0352突变株研究唾液酸酶基因在P.gingivalis生长和致病过程中所起的作用。　　 材料和方法：　　 一、实验材料　　 1、主要试剂、仪器:　　 TSB培养基(Fisher,美国)　　 质粒提取试剂盒(Qiagen,美国)　　 DNA凝胶回收试剂盒(Qiagen,美国)　　 引物(Integrated DNA technologies,美国)　　 PCR扩增仪(Bio-RAD,美国)　　 电泳仪(Bio-RAD,美国)　　 自动凝胶成像分析仪(GDS8000,UVP公司,美国)　　 厌氧培养箱(anarobic system,美国)　　 电穿孔仪(ECM630,BTX公司,美国)　　 5RACE试剂盒(Ambion,美国)　　 紫外分光光度计(Bio-Rad,美国)　　 96孔板(Falcon,美国)　　 酶标仪(Bio-Rad,美国)　　 DIG标记及杂交试剂盒(Roche,美国)　　 2、实验菌株,质粒及载体:　　 P.gingivalis W83　　 P.gingivalis ATCC33277　　 P.gingivalis FDC381　　 齿垢密螺旋体(T.denticota)ATCC33520　　 E.coli DH5α(NEB,美国)　　 pGMT easy载体(promage,美国)　　 质粒pVA2198(由纽约州立大学布法罗分校口腔生物实验室Ashu Shama教授馈赠)　　 质粒pPRS415(由纽约州立大学布法罗分校口腔生物实验室Elaine M.Haase教授馈赠)　　 二、实验方法　　 1、PG0352编码蛋白的同源性分析　　 通过PUBMED找出功能明确的唾液酸酶基因,通过Clustal W将PG0352编码的氨基酸与功能明确的唾液酸酶基因编码的氨基酸做同源比对。　　 2、5RACE和β-半乳糖苷酶活性检测　　 提取细菌RNA,采用CIP酶处理后,TAP去掉5端的2个磷酸基团,在5端加上adapter,将RNA反转录成cDNA,通过巢氏PCR寻找PG0352的转录起始位点。将PG0352启动子区插入到pRS415中,通过检测β-半乳糖苷酶活性鉴定PG0352启动子区的作用。　　 3、构建PG0352突变株　　 (1)细菌培养:P.gingivalis W83菌株接种于新鲜配制的含5％无菌脱纤维羊血,氯化血红素(5μg/ml)和维生素K(0.5μg/ml)的TSB培养基中,37℃厌氧培养5-7天。E.coli DH5α菌株接种于Luria-Bertani(LB)培养基,37℃需氧培养。　　 (2)质粒的构建:设计引物扩增PG0352上游及下游基因,顺式连接到pGMT-easy载体中,PG0352上游及下游基因之间插入BglⅡ酶切位点,然后从pVA2198中扩增红霉素基因,将其插入PG0352上游基因和下游基因之间。　　 (3)质粒电穿孔转化及突变株筛选:将100μl P.gingivalis细胞悬液和1μg构建好的质粒DNA加入无菌电极杯中,电穿孔脉冲为2500 V,5 ms。将电穿孔后细胞悬液接种于1 ml BHI液体培养基,37℃厌氧培养16 h后,菌液接种于抗性TSB培养基(含5μg/ml红霉素),37℃厌氧培养7天后收集阳性克隆,命名为PG0352突变株。　　 4、PG0352蛋白抗体的制作　　 设计引物扩增PG03525端基因,连接至pQE30表达载体中,运用IPTG诱导融合蛋白表达,应用Ni-NTA纯化蛋白,免疫小鼠,收集血清。　　 5、Southern blot　　 采用PG0352基因全长作探针,ClaⅠ租HindⅢ分别酶切细菌全基因组DNA,转到尼龙膜上,经过固定,预杂交,杂交,封闭,洗膜,发光等过程观察杂交结果。　　 6、Western blot　　 超声法制备菌体蛋白,通过12％SDS胶分离,湿转至PVGF膜上,经过封闭,一抗,二抗及与ECL底物反应,最后曝光显影。　　 7、唾液酸酶活性检测　　 将用PBS洗过的菌细胞滴到含有MUN的滤纸上,37℃,孵育15min,ChemiDocXRS成像系统紫外成像。　　 8、生长曲线的描绘　　 将菌液稀释至OD600=0.005-0.01,继续培养,定时检测分光光度(波长600),excel绘制生长曲线。　　 9、生物膜的形成　　 用1/2TSB在96孔板中厌氧培养细菌3-4天,加入结晶紫染液染色,用PBS洗3-4次,95％酒精溶解,酶标仪测OD570。　　 10、荚膜染色　　 将培养至对数生长末期的细菌涂片用复红染色,滴入印第安墨水负染,相差显微镜观察。　　 11、冰冻扫描体层摄影　　 将培养至对数生长末期的细菌,直接置入液氮中,取出4ml液体在辉光启电源的铜载网上进行菌落计数,选择合适的细菌浓度封闭,固定在玻璃质中,用电子衍射的方法成像。　　 12、抗血清试验　　 收集健康人血清,将P.gingivalis培养基中加25％血清,分别在1小时和3小时涂板,计算生存率。　　 13、动物试验检测细菌毒力　　 取10×1010 CFU/ml菌细胞0.1ml,接种于小鼠背部中线偏0.1cm处皮下,每天观察老鼠的状态,体重,皮毛的情况,注射部位有无红肿溃烂,其它部位有无异常等。　　 结果：　　 1、PG0352编码蛋白同源性分析结果　　 PG0352基因全长1580bp,编码526个氨基酸。PG0352与绿脓假单胞菌及噬二氧化碳细胞菌的唾液酸酶基因的同源性分别为46.6％和42.3％,并含有3个唾液酸酶基因特有的功能基序。　　 2、PG0352在P.gingivalis标准株中的检测　　 P.gingivalis ATCC33277,P.gingivalis FDC381和P.gingivalis W83均有唾液酸酶基因检出。　　 3、PG0352启动子序列检测结果　　 PG0352基因的转录起始位点位于-102bp处的“A”,下划线标记的“ATG”为PG0352基因的翻译起始位点,“AAACGG”为富含嘌呤的区域,启动子-10区推测为“TCLTATT”,-35区推测为“TTGGGA”。　　 4、β半乳糖苷酶活性检测结果　　 插入PG0352启动子序列的pRS415β半乳糖苷酶活性为5190.33±284.02miller,比无启动子的pRS415β半乳糖苷酶活性高100倍以上,P＜0.01。　　 5、PCR鉴定PG0352突变株结果　　 在PG0352突变株中,通过双向交换的方式原PG0352基因被红霉素基因所取代。　　 6、RT-PCR鉴定PG0352突变株结果　　 PG0352突变株中在RNA水平上没有PG0352检出。　　 7、Southern,western及唾液酸酶活性鉴定PG0352突变株结果　　 P.gingivalis W83野生株PG0352基因Southern,westerm及唾液酸酶活性结果均为阳性,而PG0352突变株均为阴性。　　 8、P.gingivalis W83野生株和PG0352突变株生长曲线的比较　　 P.gingivalis W83野生株和PG0352突变株的生长没有显著性差异,加入唾液酸酶后两者间生长同样没有显著性差异。　　 9、P.gingivalis W83野生株和PG0352突变株生物膜形成的比较　　 与P.gingivalis W83野生株相比,PG0352突变株生物膜形成能力降低,加入唾液酸后PG0352突变株生物膜形成能力有所提高,并呈浓度依赖性。　　 10、P.gingivalis W83野生株和PG0352突变株荚膜的比较　　 P.gingivalis W83有荚膜,厚度大约为20-30nm,较致密,而PG0352突变株形成的荚膜很弱,较松散。　　 11、抗血清试验结果　　 P.gingivalis W83野生株在25％健康人血清中的生存率高于PG0352突变株,1小时和3小时P.gingivalis W83野生株的生存率分别为101.14％±3.96％和77.58％±4.07％,而PG0352突变株的生存率分别为22.37％±4.07％和26.24％±2.53％,P.Gingivalis W83野生株与PG0352突变株相比有显著性差异P＜0.01。　　 12、细菌毒力检测的动物实验结果　　 P.gingivalis W83野生株组在6天内三只小鼠均死亡。PG0352突变株组中两只小鼠在第4天注射部位出现脓肿,脓肿大小为44.16 m2和28.26 m2,第8,9天脓肿破溃,另一只在注射部位没有异常,在第6天腹部出现溃疡,大小为:2mm×2mm。　　 .结论：　　 1、PG0352基因全长1580bp,编码526个氨基酸,有三个特殊的基序,编码唾液酸酶。　　 2、PG0352转录起始位点在-102bp处,可能受sigma70调控。　　 3、运用等位基因同源重组技术构建P.gingivalis PG0352突变菌株。通过PCR和反转录PCR,southern,western,唾液酸酶活性对PG0352突变菌株进行检测验证,证实PG0352突变株构建成功。　　 4、与P.gingivalis W83比较,PG0352突变株形成生物膜能力降低,但生长不受影响。　　 5、与P.gingivalisW83比较,PG0352突变株荚膜形成较弱,抗血清能力和毒力降低。