以纤维素为主要成分的植物生物质是地球上最丰富的可再生资源,对木质纤维素的高效开发利用越来越受到人们的重视。目前,人们对大量的纤维素酶认识却存在不足,没有任何普遍性规律存在,利用生物信息学统计分析酶分子的序列、结构与功能之间的关系将有助于纤维素酶催化机制的研究,寻找其共性规律,从而奠定蛋白质理性设计的理论基础。本文利用结构生物信息学展开了对GH12家族糖苷水解酶的研究,分析蛋白质家族活性架构序列谱,并对关键氨基酸进行定点设计,以期进一步阐明酶分子结合机理与催化过程。本文的主要内容以及结果如下：1.GH12家族糖苷水解酶活性架构序列谱的生成及关键氨基酸分析GH12家族糖苷水解酶分布于真菌、细菌以及占菌中,构建进化树表明进化关系较远,其拓扑结构为p-果冻卷,活性架构是马鞍型的催化凹槽、有较强的负电性,催化残基为两个谷氨酸残基。研究发现该家族蛋白质结构保守,有较好的重叠性,基于结构比对生成了GH12家族糖苷水解酶活性架构序列潜,并检验了其有效性,构建了一种快速的定位功能氨丛酸残丛及其空间组合的变化规律的方法,具有家族特异性,大大缩小了序列空间搜索强度。基于该家族活性架构序列谱中25个氨基酸残基,筛选出其中10个较高保守性的关键氨基酸,推测其中的N95、D99、E116、M118、E200与催化有关,N20、W22与底物结合有关。2.GH12家族糖苷水解酶的异源表达及重组酶性质的研究利用大肠杆菌与毕赤酵母两种表达体系对GH12家族的纤维素酶EGⅢ/Eg1A进行了异源表达,研究发现,大肠杆菌体系胞外未诱导出蛋白EGIII,周质空间只有极低的含量；通过大肠杆菌体系诱导的蛋白Eg1A分子量偏大,部分形成包涵体,酶活力降低10%；毕赤酵母表达体系则可以使两种蛋白分泌性表达,酶活力接近于本源表达。实验测定表明,Eg1A、EGⅢ对CMC反应的最适pH分别为3.9和5.0,两者最适温度都为50。C。因此,毕赤酵母表达体系更适合于GH12家族纤维素酶的表达,为后续定点突变研究奠定了技术平台。3.GH12家族糖苷水解酶活性架构中关键氨基酸的丙氨酸筛选与性质分析以GH12家族纤维素酶EGIII为代表,对活性架构序列谱中部分关键氨基酸位点N20、Y60、D99、M118以及P129进行丙氨酸筛选,研究发现这些位点突变后均造成内切纤维素酶活的降低,可见,这些位点在GH12家族糖苷水解酶降解纤维素过程中发挥着重要作用；同时不同突变体蛋白造成不同程度的酶活损失,也说明各氨基酸残基在酶的活性架构执行不同的功能。由于这些关键氨基酸都位于凹槽内侧且与糖链的一侧发生相互作用,可以识别纤维素与木葡聚糖共同的局部结构,突变体蛋白试验表明两种底物的酶活有相同的变化趋势,验证了这些关键氨基酸的空间组合应是其识别不同底物共有的结构基础。4.GH12家族糖苷水解酶活性架构中决定多功能关键氨基酸的功能分析氨基酸残基N20,Y60,D99丙氨酸筛选时酶活降低较为明显,D99与亲核基团E116形成氢键,突变为D99A、D99E与D99N,分析表明突变体蛋白均丧失了相关水解活性,证明GH12家族纤维素酶的催化机制应为催化三联体。突变体蛋白Y60A基本完全丧失相关的水解酶活,但Y60F却基本维持原酶活,说明酪氨酸残基发挥作用的是苯酚环,根据二面角推测此位点可能对于糖链在酶蛋白催化孔道中维持正确构象与走向发挥重要作用。N20与纤维素链-2位糖环C2位上的羟基形成氢键,对于结合底物起着关键作用,N20D其酶解产物谱未变化,但酶活力降低48%,这种变化应为氢键结合力减弱导致；N20A酶解后的产物谱没有单糖产生,寡糖含量升高530%,导致酶功能由EC3.2.1.74向EC3.2.1.4的快速演变,具有商业价值。