【摘 要】
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根结线虫（Meloidogyne spp.）是农业生产上一类极具有破坏性的植物病原线虫,寄主广泛,每年可导致全球农作物产量大幅度降低。作物根结线虫病传统防治方法效果有限,为此,需要开发出新的防治作物根结线虫病技术。因根结线虫寄生多种植物,且自然界里抗根结线虫植物资源有限,所以推测根结线虫抑制寄主的防卫机制可能存在保守的信号通路。随着分子生物学技术的不断发展,人们很有可能揭示根结线虫抑制寄主防卫反应
【基金项目】
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国家自然科学基金（31171825）；
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根结线虫（Meloidogyne spp.）是农业生产上一类极具有破坏性的植物病原线虫,寄主广泛,每年可导致全球农作物产量大幅度降低。作物根结线虫病传统防治方法效果有限,为此,需要开发出新的防治作物根结线虫病技术。因根结线虫寄生多种植物,且自然界里抗根结线虫植物资源有限,所以推测根结线虫抑制寄主的防卫机制可能存在保守的信号通路。随着分子生物学技术的不断发展,人们很有可能揭示根结线虫抑制寄主防卫反应机制,培育出转基因抗根结线虫病作物,从而达到防治作物根结线虫病目的。在以前的研究中,发现体外RNAi沉默根结线虫MiPDCD6基因的番茄苗的根结指数比对照番茄植株显著降低,因此推测根结线虫MiPDCD6蛋白可能抑制了番茄的防卫反应。本研究以根结线虫与番茄互作体系为研究对象,利用组织病理学技术和分子生物学技术研究了根结线虫MiPDCD6蛋白抑制番茄防卫根结线虫的机理,为培育出抗根结线虫病番茄植株打下基础,同时为寻找新的根结线虫病防治靶标提供理论依据。本研究主要取得了如下创新性结果:1、发现南方根结线虫MiPDCD6蛋白抑制番茄防卫反应与水杨酸（salicylic acid,SA）和茉莉酸（jasmonic acid,JA）通路相关。首先构建了VIGS介导的沉默南方根结线虫MiPDCD6基因番茄植株,然后人工接种根结线虫。发现接种35d后,p TRV-MiPDCD6处理组番茄根结数与对照组p TRV-PDS、p TRV-GFP、p TRV和清水处理的番茄植株相比,分别降低了57%、52%、59%和58%;卵囊数分别降低25%、62%、52%和50%,表明MiPDCD6蛋白可能抑制了寄主的防卫反应。提取MiPDCD6基因沉默后,接种南方根结线虫二龄幼虫处理后7d、14d、21d、28d的番茄根结RNA,通过实时荧光定量PCR技术分析与番茄防卫相关的水杨酸和茉莉酸通路标志性基因表达水平。结果表明:MiPDCD6基因沉默后的番茄植株响应水杨酸通路标志性基因PR-1相对于对照番茄植株,在根结线虫侵染番茄植株7d、14d、21d时相对表达量分别上调81.8%、73.5%和20.9%,PR-5基因相对于对照番茄植株在根结线虫侵染7d、14d、21d时相对表达量分别上调6.8%、78.9%和49.6%;而响应茉莉酸途径标志性基因JERF3相对于对照番茄植株在根结线虫侵染7d、14d、21d时相对表达量分别下调66.7%、70.4%和33.1%。表明MiPDCD6蛋白抑制寄主的防卫反应与SA和JA通路相关。2、发现番茄体内与南方根结线虫MiPDCD6互作的LeMYB330基因参与番茄防卫反应,与番茄体内的SA和JA通路相关。首先构建了VIGS介导的沉默LeMYB330基因的番茄植株,然后人工接种根结线虫。结果表明:在接种根结线虫21d后,LeMYB330基因沉默的番茄植株相对于p TRV-GFP、p TRV以及对照番茄植株,番茄LeMYB330基因表达量分别显著下调53%、57%和68%。表明番茄LeMYB330基因相对表达量达到显著沉默的效果。在接种35d后,p TRV-LeMYB330处理组根结数与p TRV-PDS、p TRV-GFP、p TRV和对照番茄植株相比,分别显著升高45%、50%、42%和44%。同时,提取LeMYB330基因沉默再接种南方根结线虫二龄幼虫后7d、14d、21d、28d的番茄根结RNA,通过实时荧光定量PCR技术分析与番茄防卫相关的SA和JA通路标志性基因表达水平。结果表明:LeMYB330基因沉默后番茄植株内响应水杨酸途径标志性基因PR-1相对于对照番茄植株在侵染7d、14d、21d时相对表达量分别下调33.6%、78.0%和30.9%,PR-5基因相对于对照番茄植株在侵染7d、14d、21d时相对表达量分别下调66.1%、29.0%和17.6%;而响应茉莉酸途径标志性基因JERF3相对于对照番茄植株在侵染7d、14d、21d时相对表达量分别上调69.9%、61.4%和74.8%。表明番茄LeMYB330基因参与番茄防卫反应与番茄体内的SA和JA通路相关。3、探明了南方根结线虫MiPDCD6蛋白抑制寄主防卫反应的组织病理学变化特点。VIGS介导的MiPDCD6基因沉默番茄植株,接种南方根结线虫二龄幼虫后,收集7d、14d、21d、28d、35d、42d的番茄根结进行石蜡切片。结果表明:根结线虫接种35d时,p TRV-MiPDCD6处理组番茄巨型细胞面积达到最大;而对照组p TRV-PDS、p TRV-GFP和p TRV处理的番茄巨型细胞面积在28d时,达到最大;MiPDCD6沉默番茄植株比对照处理番茄植株内的根结线虫幼虫发育迟缓。该结果表明MiPDCD6蛋白参与调控巨型细胞的发育进程。
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