丁苯酞对蛛网膜下腔出血大鼠模型早期脑损伤的研究

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目的:蛛网膜下腔出血(subarachoid hemorrhage,SAH)是临床上一种高死亡率和致残率的常见疾病,约占所有卒中病例的5‐7%。过去对其研究主要聚焦在SAH后的脑血管痉挛及其治疗上;然而,研究表明单纯治疗和控制血管痉挛并不能特别有效地改善SAH的预后,近来针对SAH后早期脑损伤的研究逐渐增多,能否通过抑制SAH后早起脑损伤的发生从而降低SAH死亡率改善预后成为了研究的一个重要方向。丁苯酞又名芹菜甲素,最初为提取于芹菜籽的一种物质,现已人工合成其消旋体,目前主要用于急性缺血性脑卒中的治疗,目前研究表明其有改善脑血流量、减轻脑水肿、保护神经,促进患者神经功能缺损的改善,作用于缺血性脑卒中所致脑损伤的多个病理生理环节,改善脑的能量代谢,抑制血栓形成,减少神经细胞凋亡的作用;SAH发生后亦有与缺血性卒中类似的微循环障碍、脑组织缺血等病理过程的发生,由于蛛网膜下腔出血发生后导致组织损伤的过程中的中也有类似的病理过程,目前少有将其应用于蛛网膜下腔出血的报道,在SAH发生的情况下,其是否能对SAH的病理发展过程产生干预保护作用,改善SAH的预后,目前尚未明确。因此,本实验通过将丁苯酞应用于SAH大鼠模型,希望能通过检测丙二醛(MDA)、肿瘤坏死因子α(TNF‐α)、白介素1β(IL‐1β)、细胞间粘附分子1(ICAM‐1)以及细胞死亡情况以了解丁苯酞对SAH大鼠模型发生的早起脑损伤是否有保护作用。材料和方法:1、实验材料成年SPF级SD大鼠60只,其中雌性与雄性各30只,体重250~330g,由广东省实验动物中心提供,于广州医科大学实验动物中心SPF级动物房普通饲料喂养1~2周后行枕大池注血法建立蛛网膜下腔出血模型。2、实验方法动物随机分为6组,分别分假手术组、对照组、实验组,每组又根据时点不同分为24小时组与12小时组,每组10只,每组动物中分别取5只用于获取组织匀浆,余下5只进行制作石蜡切片。对于实验组大鼠术后即予丁苯酞氯化钠注射液2.5mg/kg腹腔注射,对照组予等体积生理盐水替代,空白对照组不打开蛛网膜下腔与向其中注血。按对应不同组别不同时点分别取脑组织匀浆与固定后获取组织石蜡切片。所获得的匀浆液利用硫代巴比妥酸(TBA)法测得MDA含量,双抗体夹心法(ELISA)法测得大鼠TNF‐α、IL‐1β、ICAM‐1含量,并同时利用BCA(bicinchoninic acid)法测得各标本蛋白含量进行对照。所获得的石蜡切片利用TUNEL (Terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling),末端脱氧核苷酸转移酶介导dUTP缺口末端标记)荧光检测方法得到细胞凋亡情况,并经Image‐Pro Plus6.0软件处理获得死亡细胞数及总细胞数目。各项指标检测结果根据不同时点及是否给药进行T检验及χ2检验来进行比较分析,设定当P<0.05时认为有统计学意义。结果:1、死亡率:假手术组术后未出现大鼠死亡,经χ2检验,SAH术后12小时与24小时组之间p>0.05,给药组与非给药组之间P>0.05,无统计学意义。2、 MDA:12小时假手术组与24小时假手术组MDA含量差异无统计学意义(P>0.05)。SAH术后12小时及24小时给药组与非给药组MDA含量均有显著升高,各组与假手术组相比其差异有统计学意义(P<0.05),12小时给药组与24小时给药组,12小时对照组与24小时对照组之MDA含量有所差异,但无统计学意义(P>0.05)。12小时给药组较12小时对照组MDA含量较低,有统计学意义(P<0.05)。24小时给药组较24小时对照组MDA含量亦较低。3、 TNF‐α、IL‐β及ICAM‐1:假手术组12小时组与24小时组组间TNF‐α测定值差异无统计学意义,SAH组12小时及24小时给药组与非给药组TNF‐α测定值均有升高,各组与假手术组相比其差异有统计学意义(P<0.05),12小时与24小时组之间差异无统计学意义(P>0.05)。12小时组实验组较对照组TNF‐α含量较低,有统计学意义(P<0.05)。24小时组实验组较对照组TNF‐α含量较低,有统计学意义(P<0.05)。两组假手术空白对照组组间IL‐1β浓度含量测定值差异无统计学意义,SAH组12小时及24小时给药组与非给药组IL‐β测定值均有升高,各组与假手术组相比其差异有统计学意义(P<0.05),SAH组12小时与24小时组之间差异无统计学意义(P>0.05)。12小时组实验组较对照组IL‐1β含量较低,其差异有统计学意义(P<0.05)。24小时组实验组较对照组TNF‐α均值较低,但其差异无统计学意义(P>0.05)。假手术空白对照组组间组织ICAM‐1差异无统计学意义,SAH组12小时及24小时给药组与非给药组ICAM‐1测定值均有升高,各组与假手术组相比其差异有统计学意义(P<0.05),SAH组12小时与24小时组之间差异无统计学意义(P>0.05)。SAH12小时组与24小时组实验组较对照组ICAM‐1均值较低,其差异有统计学意义(P<0.05)。4、细胞死亡:12小时与24小时空白对照组都极少见死亡细胞,12小时对照组死亡率高于12小时实验组(P<0.05),24小时对照组死亡率高于24小时实验组(P<0.05),24小时对照组与12小时对照组相比较其死亡率增高,但无统计学意义(P>0.05),24小时实验组较12小时实验组其死亡率较高(P<0.05)结论:SAH发生后的早期,其脑组织中MDA、TNF‐α、IL‐β以及ICAM‐1均有升高,这可能与SAH后脑血流灌注下降、释放入蛛网膜下腔的血红蛋白等物质有关;丁基苯酞能够减少这些炎性分子的表达,减轻炎性反应的发生,降低SAH后细胞死亡率,对SAH后的神经损伤起到一定的保护作用。
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