【研究背景及目的】肝前体细胞（Hepatic progenitor cell, HPC）是损伤肝脏中出现的一种具有双向分化潜能的细胞，可向肝细胞和胆管上皮细胞分化参与肝再生。在慢性肝病状态下，HPC可被激活参与肝损伤修复，而且HPC的数量与疾病的严重程度及肝癌发生的风险指数相关。HPC既表达胆管上皮细胞标志物（OV-6、PCK和Sox9等）和成熟肝细胞标志物（白蛋白等），同时也表达肝母细胞标志物（AFP和Dlk1等）。目前，HPC来源尚不明确，传统观点认为HPC来自Hering管，也有研究显示肝细胞、肝星状细胞（Hepaticstellate cell, HSC）及骨髓干细胞在肝损伤环境下可转化为HPC。因此，有学者认为HPC可能是一种来源不同的异质细胞群。HSC位于Disse间隙，与肝细胞和肝窦内皮细胞直接接触。正常情况下，HSC处于静止状态，肝损伤时，HSC可激活，产生细胞外基质（Extracellular matrix, ECM），并分泌大量的细胞因子和生长因子。HSC的激活是肝纤维化发生发展的中心环节。近年来不断有证据提示HSC还具有促进肝组织再生的作用，同时也有研究表明HPC可来源于HSC。这些研究均表明HSC在肝脏再生过程中扮演着重要角色。基于以上背景，本课题旨在通过肝损伤动物模型明确活化HSC对HPC产生的影响，并利用体外共培养实验进一步明确HPC的细胞来源。【实验方法】一、探讨HSC活化与HPC产生的关系1、收集人急性肝炎、肝纤维化、肝硬化组织标本，免疫荧光检测HPC标志物PCK及活化HSC标志物α-SMA表达情况。2、构建2-乙酰氨基芴（2-acetylaminofluorene,2-AAF）/肝大部切除术（Partialhepatectomy, PH）动物模型诱导HPC活化。予2-AAF以10mg/kg体重的剂量对Sprague-Dawley（SD）大鼠进行灌胃，每天1次，持续5天，于第6天行肝大部切除术，手术当日停止灌胃2-AAF，术后第2天继续予2-AAF灌胃，并持续1周。分别取肝大部切除术后0天、4天、6天、9天的大鼠肝脏组织，免疫荧光检测PCK及α-SMA表达情况。3、构建对乙酰氨基酚（N-acetyl-paraaminophen, APAP）肝损伤模型。按照300mg/kg体重的剂量对SD大鼠腹腔注射APAP，仅注射1次，注射24小时后处死大鼠，取新鲜肝脏组织，免疫荧光检测PCK及α-SMA表达情况。二、明确活化HSC对HPC产生的影响（一）鉴定氯化钆（Gadolinium chloride, GdCl3）和胶霉毒素（Gliotoxin）对Kupffer细胞和活化HSC的作用1、以2ml/kg体重的剂量对SD大鼠腹腔注射20%四氯化碳（Carbon tetrachloride,CCl4），隔日注射1次，共注射2次，末次注射后48小时，予GdCl3以10mg/kg体重的剂量尾静脉注射1次。注射GdCl324小时后取大鼠肝脏组织。免疫荧光检测Kuppfer细胞标志物CD68和活化HSC标志物α-SMA的表达情况。2、对SD大鼠腹腔注射CCl4，隔日注射1次，共注射2次，在末次注射后48小时，予Gliotoxin以3mg/kg体重的剂量腹腔注射1次。注射Gliotoxin24小时后处死大鼠，取肝脏组织。免疫荧光检测CD68和α-SMA的表达情况。（二）观察抑制HSC活化对HPC产生的影响1、分离SD大鼠原代HSC，在体外予DMEM培液培养。收集体外培养后第3天（静息）和第12天（活化）的HSC培养上清。2、在2-AAF/PH模型肝大部切除术或APAP模型APAP注射前1天，予模型大鼠尾静脉注射GdCl3抑制Kupffer细胞活性及HSC活化。分别于肝大部切除术或APAP注射72小时后处死大鼠，取肝脏组织，免疫荧光检测PCK及α-SMA表达情况，对比观察抑制HSC活化对HPC产生的影响。3、在以上模型注射GdCl3抑制HSC活化后，于肝大部切除术或APAP注射的次日，腹腔注射不同活化状态的原代HSC培养上清4ml1次。48小时后取大鼠肝脏组织，免疫荧光检测PCK及α-SMA表达变化情况，对比观察补充HSC培养上清对HPC产生的影响。（三）观察清除活化HSC对HPC产生的影响1、在2-AAF/PH模型中，在灌胃2-AAF的第1、3天，同时以2ml/kg体重的剂量对SD大鼠腹腔注射20%CCl4以刺激HSC活化，并于肝大部切除术前1天，按3mg/kg体重的剂量对大鼠腹腔注射Gliotoxin清除活化HSC，于肝大部切除术后3天取大鼠肝脏组织，免疫荧光检测PCK及α-SMA表达情况，比较清除活化HSC前后HPC产生数量的变化。2、在2-AAF/PH+Gliotoxin处理的基础上，于肝大部切除术后24小时腹腔注射不同活化状态的原代HSC培养上清4ml1次。48小时后处死大鼠，免疫荧光检测肝脏组织中PCK及α-SMA表达情况，明确活化HSC对HPC产生的影响。三、明确活化HSC是否可促进大鼠肝细胞去分化为HPC1、分离SD大鼠原代肝细胞和原代HSC，利用可使两种细胞不直接接触的双层细胞共培养体系，将肝细胞分别与不同活化状态HSC共培养，光镜下观察肝细胞的形态变化。在共培养的第0、3、5天，细胞免疫荧光检测肝细胞标志物HNF4α及HPC标志物PCK、Sox9表达变化情况。2、为进一步明确与活化HSC共培养的肝细胞中出现的PCK阳性细胞具有双向分化潜能，将其置于胆管上皮细胞分化诱导液（含丁酸钠）中培养，8天后细胞免疫荧光检测胆管上皮细胞标志物CK19表达情况；将其置于肝细胞分化诱导液（含HGF、胰岛素、转铁蛋白、地塞米松）中培养，11天后细胞免疫荧光检测肝细胞标志物白蛋白（Albumin, Alb）表达情况。【实验结果】一、活化HSC促进HPC产生（一）HPC产生与HSC活化相关1、免疫荧光检测人急性肝炎、肝纤维化、肝硬化组织中PCK及α-SMA的表达情况，结果显示仅在与α-SMA阳性细胞毗邻区域存在PCK阳性细胞。2、在2-AAF/PH模型中，于肝大部切除术后0天、4天、6天、9天取肝脏组织，免疫荧光结果显示第0天和第4天时PCK阳性细胞及α-SMA阳性细胞数量均较少，但第6天和第9天时PCK阳性细胞及α-SMA阳性细胞数量明显增加，且两者紧密相联，交织存在。3、取APAP注射24小时后肝脏组织，免疫荧光结果显示PCK阳性细胞被大量α-SMA阳性细胞紧密围绕，提示HPC产生与HSC活化相关。（二）活化HSC促进HPC产生1、GdCl3可抑制Kuppfer细胞活性， Gliotoxin可清除活化HSC（1）CCl4造成急性肝损伤过程中，尾静脉注射GdCl3，取肝组织，免疫荧光结果显示与单纯CCl4急性肝损伤标本相比，CD68及α-SMA表达均明显减少。（2）在CCl4造成急性肝损伤后，腹腔注射Gliotoxin，免疫荧光检测肝组织中α-SMA及CD68表达情况，结果发现与单纯CCl4处理组相比，α-SMA阳性细胞明显减少，而CD68阳性细胞却没有明显变化。2、抑制HSC活化对HPC产生的影响（1）在2-AAF/PH及APAP造模过程中，利用GdCl3抑制Kuppfer细胞活性及HSC活化，免疫荧光结果显示抑制HSC活化后，PCK阳性细胞及α-SMA阳性细胞数量均明显减少。（2）抑制HSC活化后，再补充不同活化状态HSC培养上清，免疫荧光结果显示补充活化HSC培养上清后，PCK阳性细胞及α-SMA阳性细胞数量增加，且两者交织存在。而补充静息HSC培养上清后，肝组织PCK及α-SMA表达没有明显变化。3、清除活化HSC对HPC产生的影响（1）与单纯2-AAF/PH模型组织中存在大量PCK阳性细胞和α-SMA阳性细胞不同，腹腔注射Gliotoxin清除活化HSC后，免疫荧光结果显示肝组织中仅存在极少量PCK阳性细胞和α-SMA阳性细胞。（2）清除活化HSC后，再补充不同活化状态HSC培养上清，结果显示补充活化HSC培养上清后，PCK阳性细胞数量增加。而补充静息HSC培养上清后，PCK阳性细胞数量却没有明显变化。二、活化HSC促进大鼠肝细胞去分化为HPC1、将肝细胞与不同活化状态HSC共培养，细胞免疫荧光结果显示共培养5天时，与活化HSC共培养的肝细胞中可出现PCK阳性细胞，而与静息HSC共培养或单独培养的肝细胞中并没有PCK阳性细胞的出现。在肝细胞与活化HSC共培养的第0、3、5天细胞免疫荧光检测Sox9及HNF4α的表达情况，结果显示第0天时Sox9表达极弱，而HNF4α大量表达，至第5天时，Sox9表达量明显增多，而HNF4α表达减弱。2、将PCK阳性细胞置于胆管上皮细胞分化诱导液中培养8天后，细胞免疫荧光显示PCK阳性细胞分化为CK19阳性细胞。将PCK阳性细胞置于肝细胞分化诱导液中培养11天后，细胞免疫荧光结果显示PCK阳性细胞中出现Alb阳性细胞。【结论】一、肝前体细胞的产生伴随肝星状细胞的活化。二、活化肝星状细胞促进肝前体细胞的产生。三、活化肝星状细胞促进大鼠肝细胞去分化为肝前体细胞。四、肝细胞来源的肝前体细胞可向肝细胞和胆管上皮细胞分化。