每年在我国至少都有数百万患儿接受手术。由于不能够很好的进行配合,因此,绝大多数手术操作需要在全身麻醉下实施。在患儿安全舒适的接受手术治疗的同时,全麻药物对小儿神经系统发育的影响已经成为患儿父母、麻醉医师以及医疗管理机构共同关注的公共健康问题。关于全麻药物在脑发育的关键期引起神经发育毒性作用机制,以往的啮齿类及非人灵长类动物研究中,比较多的集中于全麻药物对发育期神经元的增殖、分化、凋亡等影响。近年来,人们逐渐认识到突触结构和功能的异常可能是全麻药物致认知功能损伤的主要机制。同源结构域相互作用蛋白激酶2(homeodomain-interacting protein kinase 2,HIPK2)是近些年发现的一种丝/苏氨酸类蛋白激酶,它能与同源框类蛋白相互作用而广泛参与转录调控。作为一种转录因子,HIPK2调控了多种生物过程,如增殖、分化、发育以及凋亡等。因此,本研究以HIPK2为突破口,着重研究七氟醚诱导发育期海马神经毒性的分子机制。研究由以下三部分组成:第一部分:HIPK2在SD大鼠中枢神经系统内的分布当前,已经明确HIPK2在小鼠脑中mRNA水平的表达变化,但是,HIPK2的分布和亚细胞定位仍然不清楚。因此,本课题采用免疫荧光染色和Western blot技术探讨了HIPK2在中枢神经系统的分布,为下面开展的工作奠定基础。目的:观察HIPK2在中枢神经系统内的变化及分布,为后续研究奠定基础。方法:利用免疫荧光组织化学和Western blot技术观察了SD大鼠从出生后到成年不同时间点的表达变化和在中枢神经系统的分布。结果:HIPK2在SD大鼠中枢神经系统广泛分布,主要表达在神经元细胞核内,少部分表达在少突胶质细胞,很少观察到在星形胶质细胞和小胶质细胞中的表达。从出生后到成年,HIPK2在嗅球、前扣带回皮层及海马的表达逐渐下降。结论:HIPK2在中枢神经系统广泛分布,主要定位在细胞核内。第二部分:HIPK2在七氟醚暴露致海马神经元凋亡中的作用近些年的研究观察到全麻药物(如丙泊酚、七氟醚等)通过增殖、分化、凋亡等多个环节影响神经元的存活。而导致这一改变的潜在机制却不甚清楚。HIPK2作为肿瘤抑制因子和DNA损伤相关激酶,能够通过磷酸化和激活P53的丝氨酸46位点调控细胞凋亡和DNA修复相关基因的表达,从而促进细胞凋亡。前期我们发现重复七氟醚暴露后海马神经元HIPK2的表达增加,并且活化的caspase3的表达量也明显增加。因此,本部分研究在前期研究的基础上通过沉默HIPK2基因,探讨其在七氟醚暴露致海马神经元凋亡中的作用,以期为全麻暴露所致的神经毒性提供新的治疗策略。目的:观察重复多次七氟醚暴露后HIPK2的表达,并构建靶向沉默HIPK2基因的慢病毒表达载体,进而探究HIPK2在七氟醚暴露致海马神经元凋亡中的作用。方法:出生后6d的SD大鼠给于3%七氟醚每天吸入2 h,连续3d。通过Western Blot和免疫荧光染色,观察重复多次暴露后6h海马神经元中HIPK2以及活化的caspase3的表达情况。与此同时,设计并构建针对HIPK2靶基因的慢病毒,转染至原代海马神经元,通过免疫荧光实验检测HIPK2慢病毒的转染效率,应用RT-PCR验证干扰效果。病毒转染3d后,处理组经过4.1%的七氟醚暴露6h后,进行相应的检测。采用CCK8比色法检测各组细胞活性,LDH检测细胞毒性,FITC/PI流式细胞仪及Western blot检测细胞凋亡。结果:重复多次七氟醚暴露后海马神经元中HIPK2及活化的caspase3的表达量明显增加。RT-PCR显示shHIPK2组较Scr组与Con组相比,HIPK2 mRNA水平明显下降(P<0.0001),干扰效率为75.29%,提示靶向沉默HIPK2的慢病毒shRNA表达载体构建成功。Scr+Sev组较Scr组相比细胞活性下降而细胞毒性增加,shHIPK2+Sev组细胞活性与细胞毒性与shHIPK2组均无统计学差异。流式凋亡细胞检测结果显示Scr+Sev组凋亡细胞数明显高于Scr组(P<0.05),而shHIPK2+Sev组与ShHIPK2组相比无统计学差异。Western blot结果显示Scr+Sev组Cl-caspase3蛋白水平较Scr组相比明显升高,shHIPK2+Sev组与shHIPK2组相比无统计学差异。结论:七氟醚使海马神经元HIPK2的表达量增加,并且神经元凋亡增加,靶向干扰HIPK2基因表达可抑制七氟醚引起的海马神经元的凋亡。第三部分:HIPK2-JNK/c-Jun通路在重复多次七氟醚诱导的突触毒性中的作用大量的研究揭示了七氟醚的凋亡效应,然而,七氟醚潜在的致认知损伤的机制仍然不清楚。越来越多的研究证实HIPK2与中枢神经系统疾病的产生以及进展切实相关。本研究以HIPK2为突破口,探索了重复多次七氟醚暴露致突触毒性及认知损伤的分子机制。为阐明全麻药物造成神经发育异常的机制,和完善儿童围术期康复策略,避免远期麻醉并发症,具有重要意义。目的:探讨HIPK2及其下游的信号通路在幼鼠重复多次七氟醚暴露所致的认知功能障碍和突触毒性方面的作用。方法:出生后6d的SD大鼠给于3%七氟醚每天吸入2 h,连续3d。在重复多次七氟醚暴露后6h分析细胞凋亡、HIPK2以及JNK/c-Jun信号通路的表达,然后给于HIPK2的抑制剂A64和JNK信号的抑制剂(SP600125)阻断HIPK2和JNK的激酶活性,并在成年后评估认知功能、树突棘密度、突触后致密带的长度以及突触相关蛋白。结果:新生鼠重复多次七氟醚暴露导致成年后空间学习记忆及恐惧记忆下降,使焦虑样行为增加,并且使树突棘密度减少、突触后致密带长度减少以及突触相关蛋白的表达下降。在前扣带回、纹状体检测到非神经元细胞的凋亡,在海马CA1区锥体神经元检测到神经元凋亡,但是成年后海马CA1区锥体神经元的数量并未发生明显变化。给于HIPK2抑制剂A64有效的改善了七氟醚引起的JNK/c-Jun信号激活导致的突触毒性和认知功能损伤。此外,JNK抑制剂(SP600125)部分恢复了七氟醚对突触发育和认知功能损伤的作用。结论:HIPK2-JNK/c-Jun信号可能是新生鼠七氟醚暴露所致的突触毒性和认知损伤的主要原因。干扰HIPK2-JNK/c-Jun信号可用于降低七氟醚引起的突触毒性。