论文部分内容阅读
泽泻(Alisma orientalis(Sam.)Juzep.)为泽泻科泽泻属多年生水生草本,块茎入药,具有利水渗湿、泄热通淋和降血脂等功效,为常用大宗药材。重金属污染已成为当前日益突出的重要生态问题之一,严重影响中药品质和产量,其对药用植物品质形成的影响可能是抑制和诱导了相关基因的表达,干预了体内的代谢过程,导致品质的改变。本课题根据中药研究特点,结合中药材质量的评价标准,对泽泻关键酶鲨烯合酶的原核表达进行研究,为阐明重金属污染对泽泻品质形成影响的分子机理奠定基础;同时研究在水体重要污染源Hg2+、Cd2+单一胁迫下,泽泻的生理生化指标、超微结构、重金属富集规律及药效成分含量等方面的影响,对提高中药品质具有理论和实践作用。论文研究内容和结果主要包括以下几个方面:1泽泻鲨烯合酶的原核表达、纯化及其多克隆抗体制备将经RACE方法克隆得到的泽泻鲨烯合酶SS基因(JX866770)插入到原核表达载体pCzn1的SacI和Xbal酶切位点之间,成功构建了 N端携带有HIS6表达标签的重组表达载体pCznl-SS。将pCznl-SS转入大肠杆菌BL21(ROSETA),以异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)诱导表达,聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析表明,在46 kD处出现一条预期大小的特异性条带,但此蛋白为包涵体蛋白,通过变复性的方式,重溶,获得目标蛋白。用纯化的融合蛋白免疫新西兰白兔,制备多抗血清,并利用蛋白与琼脂糖介质偶联制备成抗原亲和纯化层析柱对抗血清进行纯化,ELISA检测纯化抗体的效价大于512 K,BCA法测定所得抗体浓度为0.22 mg/mL,考马斯亮蓝染色观察纯化抗体的纯度在95%以上;最后以制备的兔抗血清作为一抗,用Western blotting进行检测,鉴定血清的特异性,结果表明,纯化蛋白制备的抗血清与泽泻块茎、叶柄、叶部位的体内蛋白发生特异性结合。2泽泻光合特性及其与环境因子的相互关系研究利用LI-6400型便携式光合测定仪,测定泽泻叶片的净光合速率日变化、环境因子日变化以及光响应。结果发现,泽泻叶片净光合速率(Pn)、气孔导度(Gs)与水分利用率(WUE)日变化呈双峰曲线,蒸腾速率(Tr)及气孔限制值(Ls)日变化呈单峰曲线,胞间CO2浓度(Ci)呈单谷型曲线。通过相关性分析表明,泽泻叶片Pn与主要影响因子光合有效辐射(PAR),Gs,Tr,大气温度(Ta)和WUE呈正相关,与空气相对湿度(RH),Ci和Ls呈负相关。最终得出结论,泽泻为气孔限制型阳生植物,Pn存在明显的“光合午休”现象,气孔导度、水分利用率、光合有效辐射和蒸腾速率是影响泽泻叶片净光合速率的主要环境因子,本研究为提高药材质量和产量及指导泽泻合理栽培提供了科学依据。3 Hg2+、Cd2+对泽泻生长、生理生化指标及超微结构的影响以我国《地表水环境质量标准(GB3838-2002)》和《土壤环境质量标准(GB15618-1995)》为主要指导原则,采用盆栽实验,研究两种重金属单一胁迫下对泽泻生长、生理生化指标及细胞超微结构等方面的影响。结果发现,重金属作用下,泽泻表现出不同程度的失绿,Cd2+处理组,泽泻叶片出现黑色斑点,而受Hg2+处理组其叶片均匀褪绿,未出现斑点,且泽泻各器官对Hg2+、Cd2+毒害的耐受性从弱到强依次为老叶、嫩叶、芽。泽泻株高及生物量随Hg2+和Cd2+浓度的升高而降低。Hg2+、Cd2+污染均使泽泻叶片叶绿素含量减少。较低浓度时,光合速率、超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、过氧化物酶活性及可溶性蛋白含量上升,随着污染物浓度的加大,处理时间的延长,则导致其相应生理指标下降,光合系统、保护酶系统紊乱;膜脂过氧化程度加剧,丙二醛(MDA)含量呈上升趋势;电镜结果显示:叶细胞受Hg2+、Cd2+毒害后,叶绿体膨胀至解体,出现淀粉粒和脂质球,线粒体变形,嵴突膨胀、减少,细胞核核仁分散,核膜破损,核仁消失。4 Hg、Cd在泽泻体内的富集及转移规律研究采用液相色谱-电感耦合等离子体质谱仪(HPLC-ICP-MS)测定泽泻不同部位及水、土壤中重金属的含量,考察有害物质在泽泻植物体内的富集规律。结果发现,泽泻植株不同部位的汞、镉含量表现为块茎>根系>叶,当Hg2+、Cd2+处理浓度为5 mg/L时,泽泻块茎中Hg、Cd含量分别为0.3781 mg/kg、2.5020 mg/kg,均超过了《药用植物及制剂外经贸绿色行业标准》规定的重金属含量限量标准。泽泻对根际土壤中的Cd表现出较强的富集吸收能力,同一浓度同一部位的富集系数大于Hg,而且主要集中在块茎中。泽泻对Hg。Cd的转移系数均小于1,且随着处理浓度的上升,泽泻对Hg的转移系数呈现升-降-升-降-升的趋势,对Cd的转移系数呈现先降后升的规律。5 Hg2+、Cd2+对泽泻药效成分的影响采用HPLC等方法测定重金属作用下泽泻块茎中药效成分23-乙酰泽泻醇B的积累变化规律。随Hg2+、Cd2+浓度的升高,23-乙酰泽泻醇B的含量明显下降,当汞、镉污染浓度达到10.0 mg/L时,该成分的含量比空白组下降了近55.32%、41.05%,Hg2+、Cd2+处理抑制了泽泻药效成分的合成和积累。