结核病是由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis,M tb）引起的慢性呼吸道传染性疾病,目前全球结核病防治形势依然严峻。结核病防控难究其原因是结核病的诊断、预防和治疗均面临着严重的瓶颈问题。制约结核病诊防治手段无法获得重大突破的根本原因是结核分枝杆菌的致病机制和结核病的免疫保护机制仍没有完全阐释清楚,需要更加深入研究揭示结核分枝杆菌的感染与宿主的免疫应答之间的关系,这是结核病的防控必要的科学理论基础,也是研发结核病新型诊疗工具的有效前提及支撑。长期以来NK细胞研究主要聚焦在抗病毒感染和肿瘤等相关疾病中,然而我们对NK细胞在宿主抗结核分枝杆菌感染免疫中的功能贡献仍然知之甚少。本研究拟对活动性肺结核和潜伏感染者外周血NK细胞进行研究,以期发现结核不同感染状态下NK细胞基因表达谱变化特征,为探讨NK细胞在结核病免疫作用机制提供数据支持和研究思路。本研究利用高通量RNA-seq测序技术,结合NK细胞表面特异性抗体分选富集方法,对活动性肺结核患者（TB,n=18）、结核潜伏感染者（LTBI,n=9）和健康对照者（HC,n=15）共计42例入组研究对象,进行了外周血NK细胞转录组学分析。经过数据的质控处理,共获得115G有效数据量。通过转录谱差异表达基因筛选,以P<0.05,|log2FC|>0.5为筛选标准,共获得2521个差异表达基因,包括TB与HC组间差异表达基因1291个,TB与LTBI组间差异基因548个,LTBI与HC组间差异基因673个。为了验证RNA-seq测序数据的准确性及筛选差异表达基因的代表性,我们根据基因表达量、差异显著性,以及差异表达倍数等指标,选取10个具有代表性的差异表达基因,在113例验证人群（包括活动性TB患者35例,潜伏感染者40例和正常对照38例）中进行了外周血NK细胞水平的基因表达量实时定量检测,结果显示有8个代表基因的表达量存在组间差异,具有统计学意义,证实了 RNA-seq测序数据的准确性和转录组学分析结果的可靠性。在此基础上利用GO、Pathway、GSEA等生物信息学方法进行差异基因功能富集,以及基于STRING数据库和Cytoscape软件构建的免疫相关基因蛋白互作调控网络,通过分析关键基因及功能模块,阐释宿主与结核感染以及发病状态相关的免疫应答的分子机制。RNA-seq结果显示,不同结核感染状态下宿主外周血NK细胞表达谱显著不同。GO和Pathway富集分析显示,TB vs.HC差异表达基因主要富集在免疫系统激活和调节反应、细胞激活和分泌等生物学过程以及感染（单纯疱疹病毒感染、百日咳、卡波西肉瘤相关疱疹病毒感染、百日咳等）、癌症（急性粒细胞白血病、膀胱癌等）、细胞凋亡和炎症（补体和凝血级联反应、趋化因子等）相关通路。TB vs.LTBI差异表达基因主要富集在细胞对有机物、化学物质、应激等刺激的反应、细胞激活和调节细胞增殖等生物学过程以及癌症中的转录失调通路、IL-17信号通路、TNF信号通路和Th17细胞分化、细胞因子与细胞因子受体相互作用等信号通路。LTBI vs.HC差异表达基因显著富集在细胞分泌、胞吐作用、细胞激活、血小板脱颗粒等生物学过程以及血小板激活、剪接体、溶酶体、吞噬体等细胞生物学系统相关通路以及疟疾、甲状腺癌等疾病通路。同时我们通过GSEA软件对TB vs.HC、TB vs.LTBI和LTBI vs.HC组间所有基因进行富集分析,发现了包括Fc γ受体介导的吞噬作用、B细胞受体信号通路、Toll样受体信号通路、P53信号通路、氧化磷酸化、细胞周期、缺氧、凋亡以及炎症反应等相关功能基因集。上述功能分析结果提示不同结核感染状态下的大多数差异表达基因在与抗感染、免疫和炎症相关通路中富集,其中与免疫相关基因表达改变引起我们的关注。因此我们将差异表达基因和从ImmPort数据库下载1793个免疫相关基因取交集,识别不同结核感染状态免疫相关基因（DEG-IRGs）并构建PPI网络。在此基础上进一步采用cytohubba插件,通过网络拓扑结构算法,对网络结构和节点间加权计算分析,分别筛选出与TB vs.HC和LTBI vs.HC相关DEG-IRGs排名top 30和top10的hub基因。此外我们还通过Cytoscape中MCODE算法将PPI网络划分成模块,用于模块化的研究具体功能。其中TB vs.HC相关DEG-IRGs基因PPI网络提取到2个模块,通过KEGG富集分析进一步评估模块1和模块2基因的功能,结果显示模块 1 主要与凋亡（FASLG、GZMB、PRF1、JUN、FOS、NFKBIA）、NK 细胞增殖调控（IL-15、IL-18）、趋化因子（CCR3、CXCR3、SRC、LYN、NFKBIA）以及 B 细胞信号通路（JUN、BTK、LYN、FOS、NFKBIA）相关。模块2主要涉及JAK/STAT（SOCS、JAK2、STAT1）、Toll 样受体以及 Th1/Th2/Th17 分化（CD4、JAK2、STAT1）信号通路。TB vs.HC相关DEG-IRGs基因PPI网络提取到1个模块,该模块的基因与血小板脱颗粒（PF4、A2M、VEGFB、THBS1、PPBP）、白细胞趋化正调控（PF4、THBS1、PPBP）相关。综上所述,本研究基于高通量测序技术对活动性肺结核和潜伏感染者外周血NK细胞转录组进行系统分析和差异比较,描绘了不同结核感染状态NK细胞特征性基因表达谱。进一步生物信息学挖掘发现了可能与NK细胞抗结核免疫相关的关键基因、信号通路以及功能模块,有助于拓宽对宿主抗结核免疫作用机制的认识。这些结果可为探索NK细胞在宿主抗结核免疫作用机制及寻找基于NK细胞的结核病分子标识的发现提供数据支持和参考。