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目的:1、探讨ROCK/YAP/Egr-1信号通路在内毒素(LPS)诱导人血管内皮细胞组织因子(TF)表达中的作用2、探讨YAP/P73/(BAX and BCL-2)/Caspase-3信号途径在LPS诱导人血管内皮细胞凋亡中的作用3、探讨肺组织YAP蛋白在LPS诱导小鼠急性肺损伤中的作用方法:1、蛋白免疫印迹技术(Western blot)检测LPS刺激人血管内皮细胞后TF、YAP、Egr-1以及ROCK激酶底物蛋白MYPT-1磷酸化的表达。采用Y-27632抑制ROCK激酶的活性,或者小干扰(si RNA)技术分别抑制人血管内皮细胞中YAP或Egr-1的表达,Western blot检测LPS引起的人血管内皮细胞内TF表达变化以其ROCK、YAP和Egr-1蛋白之间的相互调控关系。免疫共沉淀技术(Co-IP)检测LPS刺激人血管内皮细胞后YAP与Egr-1蛋白之间的相互作用。免疫荧光染色观察应用Y-27632抑制ROCK激酶活性前后,LPS引起血管内皮细胞中YAP蛋白表达与定位变化。2、Western blot检测LPS刺激人血管内皮细胞后YAP、P73、Bax、Bcl-2以及活化Caspase-3蛋白的表达。si RNA分别抑制人血管内皮细胞中YAP或P73蛋白后,Western blot及其流式细胞术检测LPS刺激人血管内皮细胞后凋亡率的变化以及细胞内YAP、P73、Bax、Bcl-2和Caspase-3蛋白之间的调控关系。免疫荧光染色及免疫细胞化学检测LPS刺激人血管内皮细胞后YAP蛋白磷酸化激活及细胞内定位。应用Co-IP检测LPS刺激人血管内皮细胞后YAP蛋白与P73蛋白之间的相互作用。3、气管内滴入特异性YAP si RNA抑制C57BL/6小鼠肺组织中YAP表达,苏木精-伊红染色法(HE染色)检测应用小干扰前后LPS诱导小鼠肺损伤的病理改变。结果:1、LPS诱导人血管内皮细胞中ROCK激酶底物P-MYPT1及其YAP、Egr-1和TF蛋白表达增加并且趋势基本一致;抑制ROCK激酶活性不仅抑制LPS介导的内皮细胞YAP蛋白向细胞核移位而且抑制LPS介导的YAP、Egr-1和TF表达增高;LPS促进人血管内皮细胞中YAP激活入核并与Egr-1结合;小干扰抑制YAP或Egr-1的表达可以显著抑制LPS诱导的人血管内皮细胞Egr-1和TF表达增多。2、在放线菌酮(CHX)的辅助作用下,LPS在体外诱导人血管内皮细胞凋亡发生;LPS联合CHX介导人血管内皮细胞内P-YAP(Tyr357)、P73、Bax和活化Caspase-3蛋白表达增加,Bcl-2蛋白表达降低;LPS联合CHX介导内皮细胞YAP蛋白激活后在细胞核聚集并与P73结合。小干扰抑制YAP或P73表达可以明显抑制LPS联合CHX诱导的人血管内皮细胞凋亡,并且抑制P73和Bax表达增加,逆转Bcl-2表达降低。3、抑制肺组织YAP蛋白表达可以有效缓解LPS诱导的肺组织水肿、肺泡壁增厚,炎症细胞侵润以及肺泡壁破坏;结论:1、LPS通过激活ROCK/YAP/Egr-1信号通路介导人血管内皮细胞TF表达增加。2、LPS通过激活YAP/P73/(Bax and Bcl-2)/Caspase-3信号通路介导人血管内皮细胞凋亡。3、小鼠肺组织YAP蛋白介导LPS诱导的急性肺损伤发生。