第一部分 一例由于ζ-珠蛋白高表达而存活的Hb Bart’s水肿综合征患者的遗传学研究背景α-地中海贫血是一种遗传性常染色体隐性遗传疾病,是世界人口中最常见的单基因病,其特征是小细胞性低色素性贫血。α-珠蛋白链的减少或缺失会导致过多的未配对的β样珠蛋白链形成不溶的同型四聚体,从而导致细胞内沉淀,无效造血和严重的急性溶血性贫血。地中海贫血的特征在于血红蛋白的α-珠蛋白链产生不足。当单个染色体上影响α-珠蛋白基因的突变并伴有轻度贫血的个体被称为具有“沉默”的α-地中海贫血（如果涉及一个基因）或α-地中海贫血性状（当涉及两个基因时）,而表达中度至重度溶血性贫血的复合杂合子或纯合子被称为患有HbH病。在成人体内过量的β样球蛋白链形成的非功能性β链四聚体（β4四聚体）称为HbH,在胎儿期形成称为Hb Bart’s的γ链四聚体（γ4四聚体）。α-地中海贫血的最严重形式是无α基因表达的疾病,被称为巴氏水肿胎（Hb Bart’s Hydrops Fetalis）综合征。Hb Bart’s胎儿水肿综合征绝大多数于妊娠期30～40周（平均34周）时,胎儿死于宫内或娩出后短期内死亡。全身重度水肿,腹水,呈蛙腹,少数病例无水肿及腹水。本研究中,我们发现了一例重型α地中海贫血患者,其父母均为--SEA/携带者,该患者同时遗传了父母的α大片段缺失基因成为纯合子。本文通过家系研究对患者ζ-珠蛋白表达进行定量检测,分析其表达上调的调控机制及其对患者表型的影响。材料与方法1.研究对象:先证者是来自湖南的一位9岁女性,因缺氧而早产,未出现水肿,从出生后第15天第一次接受输血,被诊断为重型地中海贫血。2岁时接受HBA基因测序显示为--SEA/纯合子,先证者的父母和弟弟均为该大片段缺失基因的携带者。2.实验方法:通过MLPA检测大片段缺失,并根据Gap-PCR的原理和方法,PCR扩增出特异性产物进行Sanger测序鉴定大片段缺失位置,从而确定家系成员基因型。通过定量PCR检测其mRNA水平,同时用Western Blot,反相液相色谱相对定量实验组及对照组ζ-珠蛋白表达水平。对先证者全基因组进行二代测序,推测影响其能够存活的基因中可能的调控位点。结果先证者被临床诊断为α-重型地中海贫血（Thalassemia Major,TM）,基因型为--SEA/--SEA,无法正常产生α-珠蛋白。其珠蛋白的mRNA水平和蛋白表达量均高于正常人和其他--SEA/携带者,在双重免疫荧光实验中可见ζ-珠蛋白荧光强度明显强于对照组样本,珠蛋白的表达上调导致了该患者的存活。先证者在宫内的各时期超声指标及出生后的生长发育数据均处于正常人群标准值的三倍标准差范围内。结论1.本研究报道了一个幸存的Hb Bart’s综合征患者,分析可知其在未经任何宫内干预治疗的情况下得以生存是由于ζ-珠蛋白代偿性表达上调。2.ζ-珠蛋白能够在患者出生后仍然持续表达,具体的调控机制和原因还有待于进一步探究分析。第二部分一批血友病患者的int22倒位突变的分型鉴定背景血友病A（hemophilia A,HA）是一种遗传性出血性疾病,是最常见的X连锁隐形遗传病,男性发病率约为1/5000。血友病患者可能在任意部位发生出血,而多数出血部位为关节肌肉,其他部位的出血包括黏膜出血,如鼻出血、口腔出血、消化道出血、泌尿道出血等;严重者可发生内脏出血和颅内出血等,直接威胁到生命。重型患者的症状尤为明显,且往往没有任何诱因;轻型患儿仅表现为出血倾向。血友病A按照基因突变涉及范围可分3类:第一类基因突变是涉及少量碱基突变,主要是碱基替换,包括错义突变、无义突变、剪接突变、基因多态性等;第二类基因突变涉及染色体结构变化,常累及1 kb至3 Mb大小的基因片段;第三类是大片段缺失和重复序列。在大约40～50%的重型血友病A患者中,已知最常见的突变类型是22号内含子倒位突变。当22号内含子中的F8A（Int22h-1）基因内基因与F8基因的两个同源区域（Int22h-2或Int22h-3）之一发生同源重组时,以及Int22h-2和Int22h-3之间先发生倒位后再分别与Int22h-1同源重组,会相应产生四种不同的倒位类型。在本研究中,我们收集了103个来自南方医院的A型血友病患者,且基因变异类型均为int22倒位,通过对其倒位类型进行分型,并进行基因型表型相关性分析。材料与方法1.研究对象:收集来自南方医院的103例int22倒位患者的DNA样本。2.研究方法:采用LD-PCR对所有样本进行基因型的分型。同时收集所有患者的表型信息,进行基因型-表型的分析。研究结果通过对103例倒位突变患者样本进行LD-PCR分型鉴定,发现基因型分别为Inv22-Ⅰ共98例,占95.15%,Inv22-Ⅱ共5例,占4.85%。卡方检验结果显示两种基因型在不同年龄及FⅧ水平的分布差异P值为P=0.670（年龄）;P=0.414（FⅧ因子活性）,两种基因型频率在不同的年龄和FⅧ水平上的分布不存在统计学差异。结论1.根据现有分型鉴定结果可知,中国人群中发生F8基因int22倒位的类型绝大部分为Ⅰ型,Ⅱ型数量较少,Ⅲ、Ⅳ型尚未发现。2.在之后的研究中,还需扩大样本量以及丰富临床信息,再进行统计学分析以明确对int22h同源序列重排进行分型是否具有临床意义。