研究背景：慢性髓系细胞白血病(chronic myeloid leukemia, CML)是一种起源于造血干细胞的恶性克隆性增殖性疾病,占成人白血病15%。如果没有治疗措施干预,疾病进展是不可避免的。目前治疗药物主要是羟基脲、干扰素、酪氨酸激酶抑制剂(tyrosinekinaseinhibitor, TKI)如伊马替尼(Imatinib, IM)等,在一定程度上干预了疾病进展,取得了较良好疗效。但仍有不少患者对药物治疗出现原发或继发耐药,尤其是进入加速期和急变期患者,文献报导IM治疗5年耐药率高达24%。IM耐药已然成为临床医生面临的一大难题,其耐药机制目前研究较多,主要有BCR/ABL基因扩增和/或过度表达、BCR/ABL基因发生点突变、非依赖BCR/ABL的耐药机制。其中非Bcr/Abl激酶依赖途径已经受到越来越多的关注,如Scr家族激酶过度激活、小G蛋白Rho信号通路等多种代偿信号转导途径的异常、新增细胞遗传学改变等。异常的骨髓微环境可以为白血病干细胞提供保护,使之免于药物的杀伤,导致白血病细胞残留、耐药、复发。从骨髓微环境方面进一步深入探索非Bcr/Abl激酶依赖途径,对克服耐药和寻找新的治疗靶点有十分重要的现实意义。Eph受体(Ephrin type receptor precursors)是膜受体酪氨酸激酶家族(receptor tyrosine kinases, RTK)中最大的一个亚群,表达于造血干祖细胞(CD34+骨髓细胞)及其周围基质细胞,其配体ephrin表达于骨髓基质细胞。Eph受体分为A、B两个亚型,其配体为ephrinA及EphrinB,均表达于胞膜,位于不同细胞表面的受配体结合后,同时发生酪氨酸磷酸化,介导双向信号转导,参与多条信号通路的转导和调节,是维持骨髓内环境稳定的的主要调节分子。Eph受体与恶性肿瘤的关系成为近年来的研究热点,其与肿瘤微环境的基质细胞相互作用,导致细胞耐药性增加,是介导粘附耐药的重要调节因子[4]。现在已经发现Eph在多种肿瘤细胞中呈现高表达,可促进肿瘤的发生发展及耐药[5],具体调控机制尚不清楚,但已有学者将其作为肿瘤生物治疗的靶点,达到抑制新生血管形成和肿瘤生长的目的[6]。EphB4是研究较为详尽的一个分子,其特异性配体是ephrinB2,可以影响血管生成、细胞迁移、轴突导向以及骨稳态调节等信号。已经发现其与多种肿瘤(乳腺癌、肝癌、胃癌、前列腺癌、肺癌、膀胱癌、卵巢癌)的发生发展相关[7-10],且对肿瘤的影响具有双重性。多数研究提示EphB4高表达促进肿瘤细胞增殖、迁移,下调其表达后则抑制肿瘤细胞生长,增强对药物的敏感性,促进肿瘤细胞凋亡。但在另一些肿瘤中亦可扮演抑癌基因的角色[11]。产生这种分歧的原因尚不清楚,可能与肿瘤类型不同,涉及信号通路不同有关,故而有必要深入探讨EphB4在肿瘤当中作用的机制。EphB4在血液肿瘤中研究较少,Momoko Suzuki等报导EphB4与Ph染色体阳性急性淋巴细胞白血病的耐药相关[12]。目前多数文献认为EphB4主要从两方面参与肿瘤的发生发展及耐药：1、调控肿瘤细胞本身的细胞生物学行为,EphB4过表达与细胞粘附能力密切相关,而细胞之间粘附力改变是骨髓基质细胞介导耐药的分子学基础；2、通过影响肿瘤血管的生成影响肿瘤的生长。而我们课题组前期研究发现EphB4在对阿霉素耐药性较高的髓系白血病细胞株(K562、HL60/ADM、KGla)中在rnRNA及蛋白水平均呈现不同程度的高表达,因此我们推测EphB4可能与髓系白血病的耐药密切相关,以慢性髓系白血病伊马替尼耐药机制为切入点,在进一步检测野生型K562细胞和K562耐药细胞(K562-R)中EphB4表达情况时发现,EphB4在K562-R细胞株中表达水平较高,然后用siRNA干扰技术建立了EphB4低表达的K562-R细胞株(EphB4-R-EphB4-sh),发现EphB4基因沉默后细胞株对药物敏感性增加,但具体涉及哪些机制尚不清晰。本实验采用了基因表达谱芯片技术,此技术具有高通量、快速、灵敏、准确的特点,可以同时测定成千上万个基因的表达水平及相互关系,以利于发现EphB4基因沉默前后涉及哪些关键分子改变,然后通过现代分子生物信息技术分析这些基因的功能、相互关系以及相关信号通路,以期进一步发现EphB4参与耐药过程的机制。研究目的：以K562耐伊马替尼细胞株(K562-R)、课题组前期建立的低表达EphB4的K562-R细胞株(EphB4-R-EphB4-sh)为研究对象。用Affymetrix表达谱芯片测定两株细胞表达谱,找出差异表达的基因,分析这些基因功能以及涉及的信号通路改变,并构建网络调节图谱,以发现EphB4参与慢性髓系白血病耐药的机制。最后挑选出部分差异表达基因,应用实时荧光定量PCR方法进行检测,验证基因表达谱芯片结果可靠性。研究方法：1.复苏K562-R细胞株及EphB4-R-EphB4-sh细胞株。因课题组建立EphB4-R-EphB4-sh细胞株时采用了GFP阳性的shRNA重组质粒,故流式细胞仪测定的GFP阳性率即可代表EphB4-R-EphB4-sh细胞株感染效率,结果大于50%提示细胞状态稳定,可进行后续实验,常规方法培养两株细胞。2.取对数生长期的两株细胞,Trizol裂解细胞后提取总RNA。对总RNA进行质量检测。检测合格后取部分行芯片检测,剩余-80℃冰箱储存。3.取质检合格的RNA共5.5ug,使用含有T7的oligo(dT)引物逆转录含有T7启动子的cDNA第一链。以第一链cDNA为模板,合成第二链DNA,形成双链DNA。纯化双链DNA,以其为模板合成生物素标记的cRNA,纯化后者提高其稳定性并片段化。在Affymetrix芯片检测系统条件下,应用GeneChip HumanGene1.OST Array人类基因组芯片杂交在45℃温度下杂交16h,之后进行洗脱和染色,扫描芯片结果。4.分析两株细胞基因表达谱的差异,差异基因定义为基因表达值倍数变化(foldchange)相差达到2倍。利用DAVID、pSTIING、Panther等软件对差异基因进行GO分析及调节网络图谱的构建。5.根据基因芯片结果挑选出部分差异表达基因,以GeneBank的序列设计各基因及内参基因GAPDH的引物,合成引物后进行下一步实验。6.将备用的总RNA逆转录为cDNA。将挑选出来的差异基因进行荧光定量PCR检测,以进一步验证芯片结果。通过熔解曲线确定PCR产物的特异性。分析各基因mRNA的相对表达量,ACT=(目的基因CT值-内参基因CT值),内参基因为GAPDH.将检测基因的ACT值进行2-△ct转换后进行统计学分析。7.统计学分析：应用SPSS13.0统计软件分析荧光定量PCR数据,检测两株细胞中基因Vavl、Rac1、NF-kB1、MAP3K7IP2、PPP1R12A的mRNA表达水平呈方差齐性,用均数±标准差描述；两组计量资料比较用两独立样本t检验,P<0.05定义为差异具有统计学意义。研究结果：1.测定EphB4-R-EphB4-sh细胞株感染效率为80%,提示细胞株状态稳定。2.基因芯片检测共筛选得到760个差异表达基因,有明确名称的基因641个。使用PANTHER数据库分析差异基因GO本体功能分析,将641个基因分为11类,占比例较大的是结合分子(33.3%)、催化活性分子(25.7%)、、转录分子(10.5%)、受体分子(9%)3.干扰EphB4基因表达后,243个基因表达上调,398个基因表达下调。进一步利用DAVID软件分析差异基因涉及的生物学过程,发现表达上调的基因涉及细胞粘附、免疫反应、细胞凋亡的负调控、大分子代谢的积极调控、细胞程序性死亡的负调控、细胞分化正调控等过程；表达下调的基因涉及蛋白质转运、血管新生、细胞形态调节、酶联受体蛋白信号通路、跨膜受体酪氨酸蛋白激酶信号通路等。4. KEGG pathway分析：使用DAVID在线软件及KEGG数据库对所有差异基因进行信号通路分析,发现差异基因涉及的信号通路主要有造血细胞生成信号通路、ECM受体相互作用信号通路、黏着斑粘附信号通路、癌症信号通路、细胞因子受体相互作用信号通路、细胞骨架调节信号通路。进一步分析通路当中涉及的细胞内信号分子,发现PPP1R12A、VAV1基因共同参与了黏着斑粘附信号通路和细胞骨架调节通路。5.使用pSTIING软件对所有差异基因进行转录调控网络图谱构建,有约40个基因处于网络节点位置,EphB4处于网络中心位置,可以调控PPP1R12A、VAV1、APC、KIT、PSMB9、MAP3K7IP2、NF-K B1等多个基因的表达。6.综合生物信息学分析结果选取部分差异基因进行实时荧光定量PCR实验,实验结果提示Vav1、NF-kB、MAP3K7IP2、PPP1R12A在敲除株呈现低表达,与耐药株之间表达差异具有统计学意义(t值分别为-47.419、-5.707、-2.924、-11.442,P值分别为<0.001、0.005、0.043、<0.001)。Rac1在敲除株和耐药株表达无统计学差异(t值为-1.887,P值为0.134),与芯片结果一致。结论：1.基因芯片具有高通量、快速等特点,是测定基因表达谱变化的有力工具。2.利用Affymetrix基因芯片检测EphB4沉默前后K562耐药细胞表达谱变化,发现了EphB4可引起多基因、多条信号通路的改变,涉及细胞凋亡、粘附、增殖、代谢等多个生物学过程以及黏着斑粘附、细胞骨架调节、癌症等多条信号通路。3.通过构建转录调控网络图谱发现EphB4处于网络调控中心位置,43个基因处于网络节点位置,包括PPP1R12A、VAV1、APC,KIT、PSMB9、MAP3K7IP2、NF-K B1等基因,提示EphB4参与耐药的机制可能与这些基因有关。4. KEGG pathway分析提示PPP1R12A和VAV1均参与了黏着斑粘附及骨架调节信号通路,因此猜测EphB4可能通过影响胞内PP1R12A和VAV1等信号分子调控细胞粘附能力,从而参与慢性髓系白血病的粘附机制介导的IM耐药。5.荧光定量PCR检测Vav1、NF-kB、MAP3K7IP2、PPP1R12A、Rac1基因表达,实验结果与基因芯片结果一致,提示芯片结果可靠准确。