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目的:NKG2A和NKG2D分别是NK细胞表面表达的抑制性受体和活化性受体,通过研究肿瘤病人体内NKG2A和NKG2D的表达,探讨它们与肿瘤免疫逃逸的关系。
方法:
1.该课题的实验对象包括正常对照组和肿瘤病例组。病例组收集手术前肺癌和直肠癌病人共29例,其中肺癌17例,直肠癌12例;对照组收集健康查体中心就诊者共10例。
2.收集以上实验对象的外周血(EDTA·2K抗凝)2ml,进行试验。每份标本均在12小时内测定完毕。
3.将实验分成4组,除阴性对照组外,每组均加入三种不同荧光素(PC5、FITC、PE)分别标记的抗体。第1组包括抗CD3-PC5抗体、抗CD56-FITC抗体、抗CD16-PE抗体;第2组包括抗CD3-PC5抗体、抗CD56-FITC抗体、抗NKG2A-PE抗体;第3组包括抗CD3-PC5抗体、抗CD56-FITC抗体、抗NKG2D-PE抗体;第4组加入三色阴性对照抗IgG1-FITC、IgG1-PE、IgG1-PC5抗体。
4.用流式细胞仪依次测定各组试管,将结果打印并存盘。
5.用全自动五分类血细胞分析仪测定各病例抗凝血的血常规。6.整理数据,分析结果。分别计算各指标包括白细胞(*109/L)、淋巴细胞(%)、NK细胞(%)、NKG2A(%)、NKG2D(%)的均值、标准差,并对病例组和正常对照组作t检验,查P值,得出各指标差异有无统计学意义。
结果:
1.正常对照组、直肠癌组、肺癌组白细胞(*109/L)均值分别为6.65,5.97,6.90,经统计学分析,正常对照组和病例组差异无显著性意义,即正常对照组和病例组白细胞数值无明显差别。
2.正常对照组、直肠癌组、肺癌组淋巴细胞(%)均值分别为36.56,30.62,28.48,经统计学分析,正常对照组和病例组差异有显著性意义,正常对照组淋巴细胞(%)明显高于病例组。
3.正常对照组、直肠癌组、肺癌组NK细胞(%)均值分别为7.42,16.23,13.12,经统计学分析,正常对照组和病例组差异有显著性意义,病例组NK细胞(%)明显高于正常对照组。
4.正常对照组、直肠癌组、肺癌组NKG2A(%)均值分别为3.48,5.03,5.13,经统计学分析,正常对照组和病例组差异有显著性意义,病例组NKG2A(%)明显高于正常对照组。
5.正常对照组NKG2D(%)均值6.42,直肠癌组12.87,肺癌组10.41,经统计学分析,正常对照组和病例组差异有显著性意义,病例组NKG2D(%)明显高于正常对照组。但是,以NK细胞设门进行分析时,直肠癌组NKG2D表达水平与正常对照无差异,而肺癌组NKG2D表达水平呈降低趋势。
结论:从该课题实验研究发现:直肠癌和肺癌患者外周血中NK细胞在淋巴细胞中的比例显著增加,NK细胞表面表达的活化性受体NKG2D呈降低趋势而抑制性受体NKG2A的表达水平较正常组显著提高。这说明:1)肿瘤患者体内NK细胞较正常对照体内NK细胞处于抑制状态,NK细胞对肿瘤细胞的杀伤功能降低;2)肿瘤细胞的免疫逃逸是多因素、复杂的机制,NK细胞是否对肿瘤发挥杀伤作用,取决于活化性受体和抑制性受体所传递信号的综合,同时与肿瘤细胞分泌抑制NK活性的分子、NK细胞分泌的杀伤相关分子谱以及NK细胞对获得性免疫的调节功能有关。因此,建议在以后的研究中,进一步研究肿瘤细胞表达细胞因子群谱特征以及NK细胞表达杀伤相关分子水平,探讨肿瘤免疫逃逸中NK细胞与肿瘤细胞作用机制,为肿瘤免疫治疗提供新的依据。