论文部分内容阅读
【目的】建立氟中毒和补钙干预动物模型,通过双向凝胶电泳(2-DE)定量蛋白质组学技术,对比氟中毒和补钙干预大鼠骨骼蛋白的表达差异,获取差异蛋白。通过生物信息学,鉴定和分析这些差异蛋白,及其相互作用、可能参与的信号通路,并通过检测PI3K/AKT信号通路相关基因和蛋白的表达水平,为探索钙缓解氟中毒的作用机制提供科学依据。【方法】选择40只120g左右的健康SD雄性大鼠,喂养普通饲料一周后,随机分为四组,分别为对照组(C,蒸馏水)、染氟组(F,100 mg/L NaF水)、染氟补0.5%Ca组(F+0.5%Ca,0.5%Ca,100 mg/L NaF水)、染氟补1%Ca组(F+1%Ca,1%Ca,100 mg/L NaF水)。喂养120 d后,称重处死,收集血液、骨骼。1.电极法测定骨氟含量;检测血清钙(Ca)含量、碱性磷酸酶(ALP)和血清抗酒石酸酸性磷酸酶(StrACP)活力;HE染色观察骨组织病理变化。2.采用2-DE联合基质辅助质量飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)筛选差异蛋白:提取四组大鼠骨蛋白,进行等电聚焦、SDS-PAGE电泳,图像采集后,用胰酶消化差异2.5倍以上的蛋白点,进行质谱分析、检索后,鉴定获得差异蛋白。用GO分析、KEGG pathway分析、STRING分析等方法,对差异蛋白进行生物信息学分析,查寻差异蛋白的生物学功能、参与的通路、蛋白互相作用;选择蛋白质谷氨酰胺转移酶2(Tgm2)、膜联蛋白A5(Anxa5)为关键蛋白。3.琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡DNA Ladder条带;采用荧光定量(RT-PCR)测定各组中Mylpf、Pfkm、Tgm2、Anxa5、Col1a1、FAK、PI3K、PDK1、PTEN、AKT、BIM、Bax、Bcl-2、Caspase-3基因的mRNA表达量;蛋白免疫印迹(Western-Blot)检测Tgm2、Anxa5、AKT、Foxo1和Bcl-2蛋白表达量;免疫组化检测Foxo1和Caspase-3蛋白表达量。【结果】1.染氟组和补钙干预组大鼠骨氟含量均高于对照组,差异有统计学意义(p<0.01),与染氟组比较,染氟补1%Ca组的骨氟含量显著降低(p<0.05)。染氟组与对照组比,血清ALP和StrACP活力升高,血清钙含量下降。与染氟组比,染氟补1%Ca组血清ALP活力显著降低(p<0.05),血清钙含量明显升高(p<0.05)。与对照组相比染氟组骨小梁粗细分布不均,小梁走向紊乱,形状不规则,骨小梁条索状结构消失。染氟补钙组与染氟组比较,骨小梁分布均匀,呈条索状结构,走向基本恢复一致。2.相比于对照组,在染氟组和染氟补1%Ca组中分离鉴定出17种差异显著的蛋白,包括Ⅰ型胶原蛋白(Col1a1)、肌动蛋白(Actb)、蛋白质谷氨酰胺转移酶2(Tgm2)等。差异蛋白参与的生物学过程、细胞组分、分子功能,主要与细胞骨架、能量代谢、物质转运、离子通道、细胞凋亡有关。这些差异蛋白富集到黏着斑(FA)、PI3K-Akt信号通路、AMPK信号通路等38条骨代谢通路,15个差异蛋白能够构建基因网络关系图,其基因都有或多或少的联系。3.染氟组大鼠骨细胞DNA相比对照组有断裂片段,染氟补1%Ca组断裂明显较轻。与对照组相比,染氟组大鼠骨细胞中Mylpf、Pfkm、Tgm2、Col1a1、FAK、PI3K、PTEN、AKT、Bax和Caspase-3 mRNA表达量升高,差异显著(p<0.05,p<0.01);Anxa5、PDK1和Bcl-2 mRNA表达量降低,差异显著(p<0.05,p<0.01)。与染氟组比较,染氟补钙组Pfkm、Tgm2、Col1a1、FAK、PI3K、PTEN、AKT、Bax和Caspase-3 mRNA表达量降低(p<0.05,p<0.01);Anxa5、Bcl-2 mRNA表达量染氟补钙组明显升高(p<0.05,p<0.01)。4.与对照组比较,染氟组Tgm2、AKT、Foxo1和Caspase-3蛋白表达量显著升高(p<0.05,p<0.01);Anxa5、Bcl-2蛋白表达量降低,差异极显著(p<0.01)。相比于染氟组,染氟补钙组Tgm2、AKT、Foxo1蛋白表达量明显降低,差异显著(p<0.05,p<0.01);Anxa5、Bcl-2蛋白表达量显著升高(p<0.05)。【结论】1.钙可调节氟中毒大鼠相关骨代谢指标,从而缓解氟中毒。2.17种差异蛋白、38条代谢通路、15个互作蛋白可能参与了钙缓解氟中毒骨骼损害的作用机制。3.钙能调控TGM2和Anxa5和PI3K/Akt信号通路相关基因和蛋白的表达缓解氟中毒大鼠骨骼细胞凋亡,因此推测,钙可能通过调节Tgm2与Anxa5表达水平,激活PI3K-Akt信号通路进而缓解氟对骨骼带来的损伤。