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第一部分miR-221在骨肉瘤细胞中的表达情况目的:1.研究不同骨肉瘤细胞系中miR-221相对于人成骨细胞(对照)的表达水平,观察是否有一致性的上调或下降。2.从多种骨肉瘤细胞系中筛选出合适的细胞系进一步实验研究。方法:1.对人骨肉瘤HOS,SaOS2,MG63,U-20S细胞,人类成骨细胞系(hFOB1.19)进行细胞培养。2.通过qRT-PCR测定各骨肉瘤细胞系和人类成骨细胞系miR-221的表达水平。结果:1.人类成骨细胞系(hFOB1.19)miR-221表达的相对值:0.031759±0.004444;HOS 细胞 miR-221 表达的相对值:0.037717±0.003754;SaOS2 细胞 miR-221 表达的相对值:0.056151±0.003706;MG63 细胞 miR-221 表达的相对值:0.104026+0.013724;U-20S细胞miR-221表达的相对值:0.144812±0.010018。各组骨肉瘤细胞miR-221表达的相对值与对照组比较均有统计学差异(P<0.05)。2.MG63,U-20S细胞的miR-221表达的相对值与对照组比较均有显著的统计学差异(P<0.01),MG63和U-20S细胞miR-221的表达水平升高特别明显。结论:不同骨肉瘤细胞系的miR-221表达水平相较于人类成骨细胞系显著升高。MG63和U-20S细胞的miR-221表达水平升高特别明显,筛选出进行下一步实验。第二部分miR-221抑制剂对骨肉瘤细胞系的生物学行为的影响目的:研究miR-221抑制剂对骨肉瘤细胞增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭能力的影响,为进一步的机制研究提供依据。方法:1.通过qRT-PCR法检测miR-221抑制剂或NC抑制剂分别转染的MG63和U-20S细胞中miR-221的表达水平。2.MTT实验检测miR-221抑制剂或NC抑制剂分别转染的MG63和U-20S细胞在0,24,48和72小时的增殖情况。3.流式细胞仪检测分析miR-221抑制剂或NC抑制剂分别转染成功后MG63和U-20S细胞的周期和凋亡情况。4.通过transwell小室实验检测miR-221抑制剂或NC抑制剂分别转染成功后MG63和U-20S细胞的迁移、侵袭能力。结果:1.miR-221抑制剂显著下调MG63和U-20S细胞的miR-221表达水平(P<0.01)。miR-221表达的下降证明了细胞转染miR-221抑制剂的成功。2.与NC抑制剂转染相比较,miR-221抑制剂转染的MG63和U-20S细胞的增殖在24(P<0.01),48(P<0.01)和72(P<0.01)小时3个时间点是显著下降的。3.miR-221抑制剂转染的MG63和U-20S细胞的G0-G1期细胞百分比和细胞凋亡率都是显著增加的(p<0.01)。4.miR-221抑制剂转染的MG63和U-20S细胞发生迁移和侵袭的数量显著下降(P<0.01)。结论:miR-221表达水平的下调能够显著抑制MG63和U-20S细胞的增殖,促进MG63和U-20S细胞的凋亡以及细胞周期停滞,能显著抑制MG63和U-20S细胞的迁移和侵袭能力。第三部分 miR-221在骨肉瘤细胞中作用的机制研究目的:1.寻找miR-221的靶基因。2.通过改变靶基因表达,研究对骨肉瘤细胞生物学行为的影响。3.找出miR-221在骨肉瘤细胞中的作用机制。方法:1.靶区扫描分析寻找miR-221的靶基因。2.将 pGL3-CDNK1B-3’-UTR(野生型或突变质粒)与 pRL-SV40 和 miR-NC(对照)或miR-221模拟物共转染到MG63和U-20S细胞中,检测相对荧光素酶活性。3.通过 qRT-PCR,Western blot 检测 miR-NC 或 miR-221 模拟物转染 MG63 和U-20S细胞后的CDKN1B/p27表达水平。4.下调CDKN1B表达水平,检测其对U-20S细胞增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭能力的影响。5.Western blot 检测 p27,Cyclin E,Cyclin D1,Bax,Bcl-2,Caspase-3,Snail和Twist1的蛋白质表达。结果:1.CDKN1B/p27 是 miR-221 的结合靶标。2.miR-221模拟物转染组的相对荧光素酶活性显著降低(P<0.01)。荧光素酶活性测定显示miR-221的过表达通过结合后者3’-UTR位点抑制了 CDKN1B/p27的转录。3.转染miR-221模拟物后,CDKN1B mRNA在MG63和U-20S细胞的表达水平显著下调(P<0.01),p27蛋白水平显著降低(P<0.05)。4.miR-221抑制剂+siCDKN1B转染显著增加U-20S细胞增殖能力(P<0.01),显著抑制G0/G1停滞(P<0.01),显著降低细胞凋亡率(P<0.01),细胞发生迁移、侵袭的数量显著上升(p<0.01)。5.miR-221抑制剂显著增加U-20S细胞中Bax和Caspase-3的蛋白表达水平(P<0.01),降低 Cyclin E,Cyclin D1,Bcl-2,Snail 和 Twist1 的蛋白表达水平(P<0.01)。然而,当U-20S细胞中CDKN1B的水平下调后,显著逆转了 miR-221抑制剂诱导的这些蛋白质表达(P<0.01)。结论:miR-221通过靶向作用于CDKN1B/p27调节骨肉瘤细胞增殖、周期、凋亡、迁移和侵袭,miR-221/CDKN1B/p27在骨肉瘤中起功能性作用,骨肉瘤细胞中miR-221下调的作用特别依赖于CDKN1B的增加。