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γ-氨基丁酸(又为氨酪酸,γ-aminobutyric acid,GABA)广泛分布于动、植物体中,是人和动植物体内一种非常重要的非蛋白质类氨基酸。GABA是动物中枢神经系统中一种有效的抑制性神经递质,具有镇静、抗惊厥、降血压、抗癫痫、增进脑活力、保肝利肾、营养神经细胞、促进生长激素分泌等功能。此外,GABA还能在非神经组织中发挥激素调节或营养因子的功能,对动物体正常的生理功能起着重要的调节作用,因而在医药及食品领域具有巨大的市场前景。目前GABA已被批准为新资源型食品添加剂,在烘焙食品、乳制品、饮料等制品中被广泛使用。谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)是生物合成GABA的关键酶,通过催化L-谷氨酸发生脱羧反应,生成GABA。该酶在低等和高等生物中都可发现。因微生物发酵产GABA不受资源、环境的约束,且生长条件简单、速度快、成本低,相对于植物富集和化学合成法,具有更广阔的应用前景。目前多种微生物中都有GAD的存在,如大肠杆菌、酵母菌、霉菌、乳酸菌等,但这些微生物的GAD均为胞内酶,提取纯化困难,且活力不高,因而不利于工业化生产。而芽孢杆菌作为一种新型药用价值化合物产生菌,自1971年首次报道能产GABA以来,研究甚少。故本文主要对产GABA的芽孢杆菌进行筛选,并对其进行发酵工艺条件的优化以及谷氨酸脱羧酶基因的克隆表达,旨在通过发酵工艺条件的优化和基因工程技术的手段提高GAD酶活,为GABA的生产和应用奠定基础。主要研究结果分述如下:1.产γ-氨基丁酸芽孢杆菌的筛选与鉴定。从不同来源的土壤样品中分离出326株菌,通过纸层析法初筛和高效液相色谱法复筛,从中筛选出3株产GABA的菌株。其中菌株X-1为芽孢杆菌,GABA含量为4.46 mmol/L。通过对其形态特征、生理生化特征进行鉴定,初步判断该菌株为巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)。对菌株X-1的16S rDNA进行PCR扩增和序列测定,并利用GenBank数据库进行同源比对,构建系统发育树,发现菌株X-1的16S rDNA(序列NR074290)与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)的16S rDNA序列同源性达99%,亲缘关系最近。结合菌株X-1的形态特征、生理生化特征,表明菌株X-1在细菌系统分类学上属于巨大芽孢杆菌(Bacilus megaterium),并命名为 5.megaterium X-1。2.5.megaterium X-1产γ-氨基丁酸发酵工艺条件的优化。首先,通过单因素实验对发酵培养基成分进行优化,确定影响GABA产量的关键因子为葡萄糖、蛋白胨、K2HPO4和磷酸吡多醛(pyrodoxal-5’-phosphate,PLP),并通过正交实验,确定最佳培养基成分为葡萄糖 30.0g/L、蛋白胨 30.0g/L、K2HPO40.6g/L、PLP0.3g/L、L-谷氨酸钠(L-MSG)10.0g/L、NaNO33.0g/L、MgSO4·7H2O0.5g/L、FeS04·7H20 0.01 g/L。其次,对其发酵条件进行单因素实验,确定影响GABA产量的关键因素为接种量、pH、发酵温度和转速,并通过田口实验,确定产GABA的最佳发酵条件为接种量2%、pH 6.0、发酵温度30℃、转速180r/min。在此条件下,发酵液中GABA浓度为22.07±1.03 mmol/L,比优化前提高了 3.94倍。3.B.megaterium X-1 GAD 基因的克隆与表达。首先,以 B.megaterium X-1 基因组DNA为模板,运用PCR技术扩增GAD基因,并克隆到pMD19-T载体上,构建克隆载体pMD-gadB,经测序正确后,将gadB与表达载体pET-30a连接,构建重组表达质粒pET-30a-gadB,并将其转化到Ecoli BL21(DE3)中,通过IPTG的诱导,实现pET-30a-gadB的表达,酶活为10.13U/mL。其次,对重组菌的表达条件进行研究,重组菌在接种量3%、IPTG浓度0.2mM、温度55℃、诱导时间为12h的条件下,酶活最高,达到15.12U/mL。最后,对重组酶进行分离纯化,SDS-PAGE电泳显示该酶分子量约为53KDa。通过对酶学性质的研究,发现该酶最适温度45℃,最适pH3.5,在温度45-55℃、pH 3.0-4.5的范围内该酶较稳定,其Km、Vmax分别为13.10 mM、201.65 U/mg。4.重组大肠杆菌细胞制备γ-氨基丁酸转化条件的研究。通过对细胞制备GABA的转化温度、PH、表面活性剂、生长因子、金属离子和底物浓度的研究,确定制备GABA 的转化条件为温度 55℃、pH3.5、PLP0.02mM、L-MSG 125 mmol·L-1,GABA的转化效率为22.01±1.26g/g.h。