黔产莪术提取工艺的研究及莪术油对直肠癌SW1463细胞株分泌相关因子的影响

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目的:优选黔产莪术所含挥发油和姜黄素的最佳提取工艺;探讨黔产莪术挥发油对直肠癌SW1463株分泌相关因子的影响。  方法:  1.水蒸气蒸馏法提取莪术所含挥发油,根据单因素实验结果,选择提取时间、溶剂倍数、浸泡时间、和药材粒度为四因素,采用L9(34)正交表设计提取工艺,以提取挥发油的体积为指标;根据药典的挥发油含量测定方法采用高效液相色谱法(HPLC)测定黔产莪术油中的吉马酮和呋喃二烯含量;  2.乙醇法提取去油莪术中的姜黄素含量,根据单因素实验结果,选择乙醇浓度和用量、提取次数和时间四因素,采用L9(34)正交表设计提取工艺,提取姜黄素浸膏;根据药典的姜黄素含量测定法,采用HPLC测定浸膏中的姜黄素含量,选择最佳提取工艺。  3.体外培养直肠癌SW1463细胞,采用MTT法筛选黔产莪术油对SW1463细胞的有效药物浓度,并计算半数抑制率IC50,根据IC50设定药物浓度80,120,160,200μg.mL-1的剂量组,采用倒置显微镜观察细胞形态变化,Giemsa染色法观察莪术油对SW1463细胞凋亡形态学的影响;  4.采用 ELISA法检测培养细胞上清中IL-2,IL-10,TGF-β1免疫因子的表达;采用Western Blot法检测培养细胞的Fas,FasL,TLR2,TLR4,C-Raf,Caspase-3蛋白表达。  结果:  1.黔产莪术鲜品100g加适量蒸馏水提取挥发油的出油量为0.4~1.2mL,折成干品后的出油率为1.48%~4.44%(mL/g)。影响挥发油提取的最大因素是提取时间,最佳提取工艺是药材粉碎粒径0.2±0.1cm,加5倍量水浸泡6h,提取8h,挥发油收率为1.2mL;HPLC测定结果吉马酮9.58%,呋喃二烯12.18%。  2.影响姜黄素提取的因素是乙醇浓度,最佳提取工艺是提取挥发油后的莪术药渣加5倍量95%的乙醇,提取2次,每次2h。  3.MTT检测发现莪术油对SW1463细胞有一定的增殖抑制作用,并呈现时间-剂量依赖性,莪术油作用细胞24h的IC50为128.28±11.84(μg·mL-1);药物作用24h的细胞形态发生改变,随着药物浓度的增大,细胞数量逐渐变少;Giemsal染色细胞可见典型的凋亡形态学特征。  4. IL-2、IL-10和TGF-β1的含量随药物浓度上升而表达减少,单因素方差分析,IL-2表达的组间差异有显著性(F=21.02,*P﹤0.05),IL-10表达的组间差异有显著性(F=23.11,P<0.01);TGF-β1表达的组间差异有显著性(F=850.97,**P<0.01);  5. Western Blot法检测培养细胞中的蛋白表达。莪术油处理SW1463细胞24h后,与对照组比较,FasL蛋白表达上调(*P<0.05,**P<0.01),Fas蛋白表达下调(*P<0.05),TLR2蛋白(**P<0.01)和TLR4蛋白(*P<0.05)表达下调,TGF-β1和C-Raf蛋白表达下调(*P<0.05,**P<0.01),Caspase-3蛋白表达上调(*P<0.05)。  结论:  1.建立了合理可行的黔产莪术油和姜黄素的提取工艺,莪术油含量测定结果表明黔产莪术可作为药材使用。  2.黔产莪术油能抑制直肠癌SW1463细胞的细胞增殖;黔产莪术油抑制SW1463细胞的作用机制可能与下调Fas/FasL通路有关,使得TOLL样受体TLR2、TLR4蛋白表达下调,使得IL-2、IL-10、TGF-β1的表达下调,导致细胞凋亡。
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