静脉全麻药丙泊酚具有起效快、作用时间短、可控性好等优点,目前已在临床麻醉、门诊短小手术中广泛应用。但其作用机制尚未完全清楚。神经递质的释放和传递是中枢神经系统(CNS)发挥功能的基础,增强抑制性神经递质的抑制作用是丙泊酚麻醉的主要机制之一。γ-氨基丁酸(GABA)是中枢神经系统最主要的抑制性神经递质,其受体分布广泛但各有自己的分布区域和不同的药理学及神经电生理学特性。利用全细胞膜片钳技术研究发现,丙泊酚通过GABA和GABAA受体复合体立体别构作用激活C1-通道从而产生中枢神经抑制作用。GABAA受体可分为突触型和突触外型,激动突触型GABAA受体可产生一种相位性抑制电流,而激动突触外GABAA受体则产生一种紧张性抑制电流,两种电流均受GABA浓度的调节。GABA浓度很大程度上取决于谷氨酸脱羧酶(GAD)的合成和γ氨基丁酸转运体(GAT)的摄取和释放作用。GAD是GABA合成的限速酶,脑内有GAD65和GAD67两种亚型,且分别是两种独立的基因调控的产物。目前GAD65相关的离体研究和在体研究主要采用转基因技术,并取得以下发现：在正常的生理状况下GAD65在GABA传递中发挥重要作用而GAD67则在某些病理状态时发挥此作用；GAD65基因敲除小鼠紧张性抑制电流明显下降,对伤害性刺激引起的疼痛的敏感性增加而对炎性痛的敏感性不变,对丙泊酚的反应性下降而对氯胺酮的反应性不变。以上研究表明GAD65在合成用于神经传递的GABA中起关键作用,GAD65介导的GABA合成在丙泊酚麻醉作用中扮演着重要的角色。GAT是一种调节GABA神经元活动的重要糖蛋白,分囊泡转运体和浆膜转运体。浆膜GAT有四种亚型即GAT-1, GAT-2, GAT-3和GAT-4(或称BGT-1),根据各亚型的分布及与GABA亲和力的大小,GAT-1是其中最重要的一种,GAT-1在调节神经终端GABA稳态方面发挥重要的作用。Wu等发现氨基己酸通过GAT的逆向转运引起邻近细胞GABA外流进而激活GABAA受体。在其随后的研究中进一步发现相位性GABA能突触传递和紧张性抑制可以被独立地调节并在控制神经兴奋性中发挥互补作用,GAT的平衡是调节突触周围环境GABA浓度和紧张性GABA能抑制性电流的决定因素。在大脑皮层不管是在相位性GABA能突触传递还是在紧张性抑制中,GAT-1都起主导作用。有研究表明丙泊酚能够以突触前机制影响GABA的摄取和释放,纯化的纹状体突触小体对[3H]GABA的摄取可以被丙泊酚剂量依赖性地可逆地抑制,丙泊酚并不影响钾离子激发的纹状体神经末梢对[3H]GABA的释放,丙泊酚对鼠脑皮层突触的自发性GABA释放和钾离子激发的GABA释放都有强化作用。也有研究表明0.3-100μM的丙泊酚不影响大鼠皮质突触体GABA的摄取和非Ca+依赖性的释放。以上研究着眼于观察GAT-1在调节GABA能神经活性方面的作用以及丙泊酚对GABA摄取和释放的影响,丙泊酚对GAT-1的影响如何目前尚未见报导。我们前期研究表明,脑摄取平衡时深麻醉组犬各脑区GABA浓度均明显高于浅麻醉组,背侧丘脑和下丘脑GABA变化率高于其他脑组织。本研究,我们采用实时荧光定量聚合酶链反应(qRT-PCR)技术观察丙泊酚脑摄取平衡时犬脑不同区域(下丘脑、底丘脑、背侧丘脑、海马、脑桥、顶叶、额叶)GAD65mRNA和GAT-1mRNA的表达,进一步探讨不同麻醉深度丙泊酚对中枢不同区域GABA合成、摄取和释放相关因子的影响。材料和方法1动物分组和标本采集18只12-18月健康杂种犬,雌雄不限,体重10-12kg(由南方医院实验动物中心提供),随机分为对照组(C组)、低剂量组(L组)和高剂量组(H组),每组6只。实验前禁食、水12h。C组不给予任何干预措施,快速静脉注射10%氯化钾(KCl)注射液2mg/kg处死；L组和H组分别由右后肢大隐静脉15s内注入1%丙泊酚注射液5.5mg/kg和7.0mg/kg,达到有效麻醉深度即(眼睑反射及踏板反射消失)后,经口插入ID9号气管导管,固定并连接呼吸机,吸入纯氧,调节呼吸频率(20-25)次／分,潮气量15ml/kg,使呼气末二氧化碳分压(PETCO2)维持在30-38mmHg,犬尾尖端接指套监测脉搏血氧饱和度(SpO2),维持SP02>95%。2%利多卡因浸润麻醉下分离右股动脉,置入22G肝素化套管,接BeneViewT8多参数监护仪监测平均动脉压(MAP)和脉率(PR),续以丙泊酚55mg/kg/h和70mg/kg/h恒速静注50min,分别取颈内动、静脉血各2m1,注入含肝素的真空采血管中,充分混匀,4℃低温保存。同时快速静脉注射10%KC1注射液2mg/kg处死实验犬。三组均解剖获取下丘脑、底丘脑、背侧丘脑、海马、脑桥、顶叶和额叶组织(0.15-0.3g),剔除血管并用生理盐水冲洗去除血迹,-80℃超低温冰箱中保存。2HPLC-UV检测丙泊酚血浆浓度血标本在4℃低温高速离心机中离心10min (3500r/min)分离血浆,取血浆200μ1置于EP管中,加入乙腈400μl后旋涡器震荡2min,再离心10min (10000r/min),取上清液20μl,采用岛津LC-20A色谱仪和SPD-M20A紫外检测器测定血浆丙泊酚浓度。色谱分析条件：色谱柱(Shim-pack VP-ODS,250mm×4.6mm),保护柱(Shim-pack GVP-ODS,10mm×4.6mm),流动相A为纯水,流动相B为甲醇,A：B为15：85,自动进样量20μl,柱温：40℃,流速1ml/min,检测波长270nm。所用试剂为分析纯。3脑区筛选方案将同一组6只实验动物同一脑区的的脑组织取等质量混和在一起,混合后的脑组织质量为0.1g。三组实验动物7个脑区的组织经以上方法处理后得到21个混合组织标本,采用qRT-PCR技术检测这21个标本中GAT-1mRNA和GAD65mRNA的表达水平,筛选出组间表达差异显著的脑区(差异倍数>2)。在筛选出的脑区,应用qRT-PCR检测每只实验动物脑组织GAT-1mRNA和GAD65mRNA的表达水平。每一反应均设两个复孔。4qRTPCR检测脑组织中GAT-1mRNA和GAD65mRNA的表达水平按照RNA提取试剂盒操作说明进行总RNA提取,提取的RNA保存于-80℃超低温冰箱中,或立即用于反转录(RT)。按照RNA反转录试剂盒操作说明进行RT,反应条件为42℃30min,100℃3mm,反应产物cDNA置-20℃保存。利用SYBR Green I染料法进行qRT-PCR检测,反应条件：预变性95℃10mmin,扩增与定量95℃10s,60℃30s,共40个循环。反应结束后制作熔解曲线(条件为从55℃到95℃以0.1℃/s的速度逐渐升温并持续进行荧光定量)。将从MXPro4.01软件输出的Ct值利用2-ΔΔCt法进行计算。5统计学处理采用SPSS13.0统计软件。计量资料用均数士标准差表示(x±s)。L组及H组颈内动、静脉丙泊酚血浆浓度的比较采用配对t检验。两组之间颈内动脉丙泊酚血浆浓度的比较及颈内静脉丙泊酚血浆浓度的比较采用独立样本t检验。组间同一脑区GAT-1mRNA及GAD65mRNA表达水平的比较及组内不同脑区变化率的比较均采用单因素方差分析,满足方差齐性的多重比较采用LSD法,不满足方差齐性的多重比较采用Tambane’s法,P<0.05为差异有统计学意义。结果1一般情况三组实验犬年龄、体重、性别均无显著性差异。实验过程实验犬呼吸循环平稳,无呕吐、呛咳等不良反应,平均动脉压和脉搏在犬正常生理值范围内波动。丙泊酚恒速静注50min时,L组和H组MAP分别为(77.00±6.90)mmHg.(54.17±5.98)mmHg,PR分别为(115.50±5.17)次/分、(89.00±4.10)次/分,差异均有统计学意义(P<0.01)。2颈内动、静脉丙泊酚血浆浓度静脉输注50min时,L组颈内动、静脉丙泊酚血浆浓度分别为(3.18±0.06) μg/ml和(3.12±0.09)μg/ml,差异无统计学意义(P>0.05)；H组颈内动、静脉丙泊酚血浆浓度分别为(6.21±0.07)和(6.13±0.11)差异无统计学意义(P>0.05)。两组之间丙泊酚血浆浓度(动脉-动脉,静脉-静脉比较),差异有统计学意义(P<0.01)。3脑区筛选结果等质量预混法筛选结果表明,下丘脑、背侧丘脑和海马GAT-1mRNA和GAD65mRNA的表达水平,L组和H组与C组比较有明显差异,而其它脑区未见明显差异。4不同脑区GAT-1mRNA和GAD65mRNA的相对表达量下丘脑GAT-1mRNA的相对表达量,L组和H组(1.76±0.08,1.91±0.21)均明显高于C组(1.09±0.46；P<0.05&P<0.01),L组和H组之间差异无统计学意义(P>0.05)。海马GAT-1mRNA的相对表达量,L组和H组(1.85±0.41,2.03±0.33)均明显高于C组(1.03±0.27；P<0.01),L组和H组之间差异无统计学意义(P>0.05)。下丘脑和海马GAT-1mRNA相对表达量的变化率,L组分别为61.26%±7.17%和79.34%±39.95%,H组分别为74.64%±19.63%和97.12%±32.31%,差异均无统计学意义(P>0.05)。背侧丘脑GAT-1mRNA的相对表达量三组无统计学差异(P>0.05)。背侧丘脑GAD65mRNA的相对表达量,L组和H组(1.69±0.28,1.75±0.30)均明显高于C组(1.09±0.43；P<0.01),L组和H组之间差异无统计学意义(P>0.05)。表达量的变化率L组和H组分别为59.28%±27.02%和60.980±27.85%。下丘脑和海马GAD65mRNA相对表达量三组无统计学差异(P>0.05)。结论1恒速静注50min时,犬脑对丙泊酚的摄取处于平衡状态。此时,丙泊酚可明显上调下丘脑和海马GAT-1mRNA以及背侧丘脑GAD65mRNA的表达。2本实验,丙泊酚对犬脑GAT-1mRNA和GAD65mRNA的影响呈非剂量依赖性。