大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)是一种半活体寄生的土传维管束病原真菌,能够引起数百种双子叶植物黄萎症状,严重危害多种重要农作物的品质和产量,尤其对于我国棉花的生产造成了重大的损失。黄萎病菌主要侵染棉株的维管束,使棉花维管束变成灰色,重则变成深褐色,导致棉花输导组织受阻,使棉花叶片变黄、枯萎,棉铃脱落,造成棉花死亡而造成减产。至今尚无防治黄萎病的有效药物,培育抗性品种是目前控制黄萎病的主要方法。目前,人们对大丽轮枝菌的分子遗传基础和致病机理的相关研究不足,因此,要控制黄萎病的发生,需要深入研究病原菌及其致病机理,找出控制致病性的关键基因。致病有关基因的研究主要集中于由大丽轮枝菌分泌且与宿主互做的一些蛋白因子相关基因。这些蛋白因子对于大丽轮枝菌的致病起到了多方面的作用,如协助病原菌进入宿主细胞,调控宿主细胞的信号转到及抑制宿主的免疫防御反应。真核病原微生物如病原真菌,在侵染宿主时,会分泌相当数量的效应蛋白作用于宿主侵染过程。已有报道一些病原真菌分泌的小的蛋白因子是与宿主出现的疾病症状有关,而他们发挥功能主要以无毒因子的形式与宿主细胞内R蛋白发生相互作用。这类蛋白的典型特征为分子量小,有限的系统发育分布。这很有可能是由于病原与宿主在协同进化的过程中加速自身进化。随着研究的深入,这些蛋白因子的功能也逐渐被阐释清楚。对于大丽轮枝菌,已有研究表明其分泌的蛋白是是造成其生物毒性的主要原因,因此,深入研究大丽轮枝菌基因组范围内的所有分泌蛋白,将为其揭示致病机理,开发黄萎病防治新药剂、新方法奠定基础和培育抗性品种奠定基础。随着大丽轮枝菌全基因组序列测序的完成,研究人员开始应用生物信息学方法预测基因组范围内分泌蛋白,并分析其特点和功能,为深入研究黄萎病菌的致病机理和发育机制提供了坚实的基础。本研究通过预测某种大丽轮枝菌分泌蛋白,并进行了致病性、生理生化等方面的研究,发现该蛋白与其致病性无关,而与微菌核的形成及菌丝形态有关。黄萎病之所以很难防控,是由于其自身会形成一种休眠结构──微菌核,可以在宿主不存在的土壤中存活20年以上,是大丽轮枝菌的主要初侵染来源。为了明确微菌核形成的分子调控机制,我们构建了大丽轮枝菌的敲除突变体系,进而研究了与微菌核形成有关的基因antigen1的功能。取得了以下结果:1.采用融合PCR法构建了antigen1基因敲除载体pzptk 8.10-antigen1;利用农杆菌介导转化法(ATMT)成功转化了野生型大丽轮枝菌V991,并获得了4株antigen1基因缺失突变体。在潮霉素筛选的条件下连续传代5代,获得稳定遗传的大丽轮枝菌转化子,PCR及RT-PCR检测。2.构建了anttigen1互补载体pNTP-antigen1,选择标记为壮观霉素抗性基因Spectinomycin。通过农杆菌介导法将互补载体导入到⊿antigen1突变体中,获得了多个阳性转化子。根据菌落形态、生长速度、遗传稳定性和致病性实验筛选与野生型Vd991相似的转化子,其中Vd-compl转化子遗传稳定,致病能力和表型特征与Vd991相当,可以作为互补转化子。3.测定了antigen1基因缺失突变体的菌落形态、菌丝生长速度、致病性、压力敏感性、微菌核产量、气生菌丝和基内菌丝形态及微菌核萌发情况,初步明确了antigen1基因与大丽轮枝菌的菌丝生长及微菌核的形成有关,与致病性无关。