肝癌是世界上最常见的第五大恶性肿瘤,第三大常见的癌症致死原因;目前肝癌的主要治疗手段为手术治疗、肝移植、肝动脉化疗栓塞术、射频消融治疗,但各治疗手段均有局限性,因而肝癌患者的生存率低下,结合肝癌的发病机制研究进而开发新的治疗方法成为当下肝癌治疗的迫切需要。研究人员一直试图阐明肝癌的发生机制以及细胞起源,近年肿瘤干细胞研究进展对肿瘤的发生发展及治疗有了新的认识。肿瘤干细胞理论认为:肿瘤组织中仅有一小部分(<1.0%)肿瘤细胞有致瘤性,绝大多数肿瘤细胞没有或仅有有限的增殖能力,这小部分肿瘤细胞因具有永生不死、持续分裂、分化的能力,称为肿瘤干细胞。肿瘤干细胞的发现突破了人类对肿瘤发生及复发的认识,另外针对肿瘤干细胞的治疗也成为未来肿瘤治疗的希望。因此发现不同种类肿瘤其相应的肿瘤干细胞使肿瘤的干细胞治疗成为可能,同时对肿瘤的早期诊断和治疗意义深远。那么分离和鉴定特定肿瘤的干细胞成为目前医学研究的热点之一,这也是本课题的重点研究内容。随着肿瘤干细胞研究工作开展,近年来认为可能产生肿瘤干细胞的决定因素有:遗传不稳定性、微环境、细胞融合和水平基因转移。目前许多研究认为肿瘤干细胞源自正常成体干细胞,肿瘤干细胞与正常成体干细胞有很多相似的特性,而且二者共享很多信号通路,如果正常成体干细胞长期处在致癌微环境下,DNA损伤修复无法及时有效完成,关键基因异常、失活或信号通路失调等等,这些因素都可能致使正常的成体干细胞转化为肿瘤干细胞。但目前对肿瘤干细胞的来源探讨,仅局限于研究人员各自领域,其实验结果仅仅是真正的全面的肿瘤干细胞形成机制中的一部分。肿瘤干细胞起源还有待于进一步大量而全面的研究。许多研究表明肿瘤干细胞表面有其独特的标志物,如何利用这些特有的标志物分离和鉴定肿瘤干细胞,是将肿瘤干细胞应用于肿瘤诊断和治疗的首要问题,同时肿瘤干细胞的形成机制也是现代医学待解决的问题。因此,本课题选择了恶性程度高的肝癌细胞作为研究对象,分离和鉴定CD34阳性的肝癌干细胞,并探讨了其形成的可能机制。本课题由两部分研究组成,第一部分是CD34+肝癌干细胞(LCSCs)的分选、鉴定及如何将分选的CD34+LCSCs体外培养,第二部分是CD34+LCSCs来源的探讨。第一部分人肝癌干细胞分选、鉴定和培养常规分离PLC肝癌细胞(Primary Liver Carcinoma,PLC/PRF/5),结合CD34抗体流式筛选CD34+肝癌细胞。分选后的CD34+肝癌细胞,分别进行体外培养、免疫组化、PCR、成瘤性及体外分化实验来鉴定是否具有肝癌干细胞(LCSCs)的形态学和生物学特性。用建立的方法体外培养,维持其肝癌干细胞特性。1、CD34+PLC分选及肿瘤干细胞特性检测课题组前期工作通过流式细胞仪检测发现人肝癌细胞系PLC中CD34+细胞为3%到6%,高于HepG2等其它6个肝癌细胞系。因此用CD34抗体结合CD44、CD133、OV6和EpCAM4个抗体标记分选得到CD34+PLC细胞、CD34-PLC细胞、8 个 CD34+PLC 亚群(CD34+CD133±、CD34+CD44±、CD34±EpCAM±和CD34+OV6±),以及4个双阳标记CD34+亚群细胞(CD34+CD133+、CD34+CD44+、CD34+EpCAM+和CD34+OV6+)体外培养后子代细胞分选出来的4组细胞(CD34-CD133+、CD34-CD44+、CD34-EpCAM+和CD34-OV6+)分别注射到NOD/SCID/IL2RG小鼠皮下;祖细胞PLC也同时注射相同的小鼠模型,各个实验组在3个月内形成的小鼠移植性肿瘤。结果显示CD34+PLC仅100个细胞即可成瘤;而在相同的成瘤时间,CD34+PLC各组仅需1000个细胞成瘤,而PLC和CD34-PLC需要100000或更多细胞数。接种100个细胞数即可成瘤,表明CD34+PLC如同LCSCs具有非常强的致瘤性,提示CD34+具有LCSCs一样的功能。对CD34+PLC形成的移植瘤进行鉴定。从不同的CD34+PLC中分选出了 8个CD34+亚群及其4个子细胞群均能形成人肝癌(Human Liver Cancer,HLC)移植瘤,并分为3个表型肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)、混合型肝细胞-胆管细胞癌(Combined Hepatocellular Carcinoma,CHC)和肝胆管型肝癌(Cholangiocarcinoma,CC)。这是第一次证实CD34+细胞具有CSC的特性能自我更新,能分化行成HLC移植瘤;也是第一次发现LCSCs在动物模型中生成三种表型HLC,说明CD34+PLC具有多能性;而12个细胞亚群都是同一个来源,都能独立地形成肿瘤,说明他们可能是肿瘤起始细胞(TICs)。免疫组化HE染色显示CD34+PLC移植瘤具有典型的人肝癌组织学特征。免疫荧光结果表明人移植瘤组织表达人肝特异性蛋白:白蛋白、甲胎蛋白、αl抗胰蛋白酶和EpCAM。分离的CD34+PLC可以在小鼠成纤维饲养层细胞(Mouse Embryo Fibroblasts,MEFs)上克隆扩增自我更新,表明它们具有干细胞的特性。CD34+PLC表达肝干细胞标志物以及公认的肿瘤干细胞标记。以上结果提示分选的 CD34+PLC 为 LCSCs。2、CD34+LCSCs体外培养目前分选CSC的方法较多,但还鲜有CSCs体外长期培养的稳定可靠方法。为了研究CD34+LCSCs体外培养条件和传代后细胞形态及功能,把刚分选获得的CD34+LCSCs单个细胞,置于小鼠胚胎成纤维细胞(MEFs)饲养层细胞上培养,经过7-10天的培养,形成一个圆形克隆细胞,每个克隆形态各异,说明具有多态性。CD34+LCSCs不仅可以在MEF饲养层细胞传代和培养,也可以冷冻保存和复苏。把CD34+LCSCs培养到第12代后冻存和复苏,细胞形态与未冻存的相似。CD34+LCSCs还可以在ECM肝癌干细胞专用平板上培养,可以去除MEFs饲养层细胞后短期培养,依然保持细胞形态。为了评价CD34+LCSCs克隆细胞的成瘤能力,分别用刚分选出的CD34+LCSCs细胞和培养的CD34+LCSCs克隆细胞(第5,18代)裸鼠皮下注射,成瘤所需时间和细胞数没有差别。免疫组化HE染色显示CD34+LCSCs克隆细胞形成的移植瘤具有典型的人肝癌组织学特征。将MEFs上培养的CD34+LCSCs细胞克隆与特异性标记的抗体免疫染色,实验结果显示干细胞标记物:CD117(c-kit)和SOX2;正常肝干细胞标志物:AFP、CK19和OV6;及肿瘤干细胞标志物:CD44、EpCAM、CD133和CD31,CD34+LCSCs均有表达。SOX2与干细胞的多能性和自我更新特性相关,免疫组织化学在CD34+LCSCs克隆细胞中检测出SOX2表达,提示SOX2在CD34+LCSCs高表达,并是调节LCSCs的重要因素。为了评估在CD34+LCSCs克隆细胞体外诱导分化结果,在第0、4、9、和13天分化后的收获细胞。定量PCR评价肝(癌)标志物白蛋白(ALB)、甲胎蛋白(AFP)和CK7,CK19;肝癌干细胞标志物CD133、CD44、CD90和EpCAM,以及CD34和CD31基因的表达。除了CD34下降、CD133(day4)和CD90(day9)没有显著升高,其他基因的表达均比day0天显著增加(p<0.05),其中EpCAM、CD44持续高表达,ALB、AFP、CK19、CK7和CD31的表达随时间增加(p<0.05)。本研究用CD34标记从人肝癌细胞PLC中成功分离CD34+PLC,经鉴定其为LCSCs;并发现HLC可能由CD34+细胞形成,从而揭示出人类肝肿瘤起源的多样性。本研究成功地在体外培养和扩增CD34+LCSCs,在饲养层细胞上长期培养CD34+LCSCs并保持其致瘤性和多潜能性,并且在我们实验条件下CD34+LCSCs可以像正常干细胞如ESC和iPSC那样在体外培养和扩增。第二部分CD34+LCSCs来源探讨1、CD34+LCSCs表达髓单核细胞标志物、肝干细胞标志物及CD45通过qPCR在CD34+LCSCs中检测到肝胆干/祖细胞(HSPC)的标志物OV6;单核/巨噬细胞标记物CD14、CD68、甲胎蛋白(AFP)、溶菌酶和α1-抗胰蛋白酶(α1-AT)。一般正常造血干/祖细胞不表达单核细胞基因;然而,CD34+LCSCs共表达CD68、CD14、CD31等巨噬细胞的抗原,表明肝干/祖细胞标记物和粒细胞标记物在同一细胞中表达,这说明CD34+LCSCs是表达来源于肝胆干/祖细胞(HSPC)和单核细胞(单核细胞/巨噬细胞)两种不同的细胞的混合表型。免疫组化检测CD34+LCSCs形成的人肝癌移植瘤,结果显示共表达Hep PAR1和CD68,CK19和CD68,AFP和CD68,以及αα1-AT和CD31。表明肝(癌)标记物和单核细胞标记物标记在同一细胞中表达,为杂交细胞表现出俩个亲本细胞表型。再次提示CD34+LCSCs可能是HSPC与单核细胞融合形成的细胞。免疫荧光检测CD34+LCSCs共表达OV6和CD45、CD45及巨噬细胞抗原。CD34+LCSCs形成的移植瘤细胞表达肝细胞癌标志物和CD45(Hep Par1和CD45,CK19和CD45),这表明CD34+LCSCs可能来自一个CD34+造血前体。2、PLC细胞和CD34+LCSCs移植瘤表现巨噬细胞特征吞噬实验检测CD34+LCSCs移植瘤细胞、PLC、阳性对照组TIB和阴性对照组293T对大肠杆菌(E.coli)的吞噬能力,结果证实CD34+LCSCs移植瘤细胞和PLC具有吞噬大肠杆菌(E.coli)的能力(p<0.05);通过qPCR检测CD34+LCSCs移植瘤细胞、PLC,实验结果表明CD34+LCSCs移植瘤细胞、PLC表达细胞因子IL-1b、IL-6、IL-12A、IL-18、TNF-α、CSF1(M-CSF)和趋化因子IL-8、CCL2、CCL5(p<0.05),而且INF-γ、IL-4和LPS会促进这些因子表达(p<0.05),其中TNF-α、CSF1、IL-12A、CCL2、CD68和CD14在CD34+LCSCs移植瘤中表达增强(p<0.05),表现出巨噬细胞的特性。3、CD34+LCSCs移植细胞和PLC的人肝表型通过qPCR检测CD34+LCSCs移植瘤细胞、PLC和HepG2,与HepG2相比CD34+LCSCs移植瘤细胞和PLC表达Ⅰ和Ⅱ期代谢酶CYP3A4、CYP2C9、CYP2C19、UGT1A1、UGT1A3、UGT1A6、UGT1A8、UGT1A10和Ⅲ期的转运蛋白、葡萄糖转运蛋白2(GLUT2)(p<0.05),其中CYP2C9、CYP2C19、UGT1A1、UGT1A6、UGT1A8、UGT1A10和Glut2在CD34+LCSCs移植瘤细胞中表达更显著(p<0.05)。说明CD34+LCSCs移植细胞和PLC具有人肝表型。4、基因组学、细胞遗传学分析两种不同的细胞类型融合产生的杂交异核体细胞最初包含两种类型细胞的遗传因素的和细胞器。由此进行了CD34+LCSCs染色体细胞遗传学分析。结果显示,CD34+PLC中平均模态数(50-60)的染色体为82%,13%的CD34+PLC细胞染色体数目在90-116的范围;因此猜测,染色体数目从50-60的细胞是LCSCs的后代,是LCSCs衍生物在增殖或分化过程中额外的核被挤出。在PLC中平均模态数(50-60)的染色体为76%,12%的PLC细胞染色体数目在90-116的范围,与CD34+PLC相类似分布。由于PLC在其基因组中整合乙肝病毒(HBV)DNA,检测是否CD34+LCSCs也整合HBV表面抗原基因(S),核心基因(C),聚合酶基因(P)和HBVDNA连结。PCR发现他们在PLC和CD34+LCSCs中相似,而在Hep G2细胞是阴性。测序发现HBV DNA连接的DNA片段序列有3个碱基对不同(TCT代替CTC),PCR和测序确定这三个突变在CD34+LCSCs和PLC,表明PLC肝癌形成可能是起源于CD34+LCSCs。通过以上探讨CD34+肝癌干细胞的来源的研究表明,CD34+LCSCs表现出肝干/祖细胞(HSPC)和单核细胞的混合表型,而且CD34+LCSCs形成的人肝癌移植瘤也显示肝癌与骨髓单核细胞混合表型。这表明,CD34+LCSCs可能是融合细胞。实验结果显示在同一细胞中共存两种不同类型的细胞的细胞功能,细胞分泌表达肝细胞来源的白蛋白同时也表达细胞因子和趋化因子表达和具有单核细胞的吞噬作用,证明LCSCs是通过融合所形成的。CD34+LCSCs表达CD45,展示它的起源似乎是从造血前体。所以本部分研究的结论是,CD34+LCSCs可能是由CD34+造血细胞来源的髓样细胞融合形成的中间体。综合本课题的两部分研究,取得了以下成果:1、从人肝癌细胞PLC中成功分离CD34+PLC,经鉴定其为肝癌干细胞(LCSCs);2、可分化形成肝细胞癌三种表型,发现HLC可能由CD34+细胞形成,从而揭示出人类肝肿瘤起源的多样性。成功地体外培养和扩增CD34+LCSCs,证明CD34+LCSCs可以像正常干细胞如ESC和iPSC在体外无限的培养和扩增。3、发现一个肝癌来源于CD34+造血前体干细胞,报道人类癌症干细胞可能是融合形成。CD34+LCSCs的系列实验研究结果,丰富了肝癌干细胞理论,探讨肿瘤的发生和发展的机制,并确定肿瘤干细胞特定的生物标志物,可用于肝癌早期诊断及药物对CSC疗效评价和新药开发,对肝癌治疗的临床研究提供重要依据。