胰腺癌是一种严重危害人类健康的常见恶性肿瘤。在我国其死亡率迅速增高,近年仍呈上升趋势,占恶性肿瘤死因的第7～8位。胰腺癌的高死亡率与其高侵袭性的生物学特性密切相关。研究胰腺癌的侵袭转移的相关机制,可为胰腺癌的治疗提供理论基础。Ezrin是在各种肿瘤组织中表达均升高的蛋白,本实验室通过蛋白质组学技术也验证了其在胰腺癌组织中的高表达。Ezrin的高表达与肿瘤转移密切相关。我们在前期研究[1]中通过定量蛋白质组学的方法首次发现C14orf166在转移的胰腺癌中高表达。近期有研究[2]进一步支持C14orf166可能参与了胰腺癌的发病过程,但其机理尚不清楚。任何一种蛋白质起作用都是通过与其他蛋白的相互作用实现的。本研究拟通过筛选Ezrin、C14orf166的的相互作用蛋白,为揭示肿瘤转移的机制奠定基础。为此,我们在293T细胞中分别高表达了带标签的Ezrin、C14orf166蛋白,然后利用Ni-agrosc进行His标签蛋白的pull-down纯化,分离Ezrin、C14orf166的蛋白结合复合体,对蛋白混合物进行SDS-PAGE分析,选择差异条带,进行MALDI-TOF-TOF和LC/MS/MS质谱鉴定。目前C14orf166与肿瘤的关系研究主要来源于比较蛋白质组学,本研究拟通过基因工程技术研究C14orf166对肿瘤细胞生物学特性的影响。为此,我们将构建的真核表达载体转染肿瘤Hela细胞,以提高细胞中C14orf166的蛋白表达水平,然后比较转染组和空转组细胞增殖能力和迁移能力的变化,研究C14orf166对Hela细胞增殖和迁移能力的影响。本研究分为三个部分：　　 第一章：Ezrin、C14orf166真核表达载体的构建及其在293T细胞的表达。　　 目的：构建含有Ezrin、C14orf166基因的真核表达载体,并使其在293T细胞中表达。　　 方法：提取人胰腺癌Panc-1细胞总RNA,RT-PCR法扩增Ezrin、C14orf166基因。将扩增得到的基因片段,利用PCR引入酶切位点和标签,与pcDNA3.1质粒连接,获得pcDNA3.1-Falg-Ezrin-His和pcDNA3.1-Flag-C14orf166-His重组质粒,转化E coliDH5α,双酶切后测序鉴定。将测序正确的重组质粒转染293T细胞,48h后,利用RT-PCR和Western-bolt验证外源基因的表达情况。　　 结果：RT-PCR扩增出的基因片段与理论DNA表达片段大小一致,测序鉴定显示克隆的基因序列与GenBank报道序列相符。RT-PCR、Western-blot证明外源基因在293T细胞中成功表达。　　 结论：成功构建了表达载体pcDNA3.1-Flag-Ezrin-His、pcDNh3.1-Flag-C14orf166-His,在293T细胞中成功表达。　　 第二章：Pulldown结合蛋白质组学方法发现Ezrin、C14orf166相互作用蛋白。　　 目的：筛选人胰腺癌细胞中与Ezrin、C14orf166蛋白相互作用的蛋白。　　 方法：利用脂质体将真核表达载体pcDNA3.1-Flag-C14orf166-His、pcDNA3.1-Flag-Ezrin-His转染至293T细胞。采用Ni-agrose进行His标签蛋白的pull-down纯化,分离Ezrin、C14orf166的蛋白结合复合体,对蛋白混合物进行SDS-PAGE分析,选择差异条带,进行LC/MS/MS或MALDI-TOF-TOF质谱鉴定。　　 结果：质谱鉴定结果共筛选出可与Ezrin重组蛋白相互作用的3种蛋白,其分别为:RPS9、NRAP、Leucine-rich glioma-inactivated proteinl;C14orf166重组蛋白相互作用蛋白:RPS13、CKMT1B、CKMT1A、EEF1A、RPS13、RPS15、RPL27A、Tu translation elongation factor、TCEB1等19种。　　 结论：Pull-down结合质谱的方法在筛选蛋白相互作用蛋白方面是可行的,成功筛选、鉴定得到与Ezrin、C14orf166蛋白相互作用的蛋白。　　 第三章：C14orf166对肿瘤细胞生物学特性的影响。　　 目的：研究C14orf166对肿瘤Hela细胞的增殖能力和迁移能力的影响。　　 方法：利用基因转染的方法,提高C14orf166蛋白的表达水平,分别利用MTT实验、Transwell实验检测转染组和空转组细胞的增殖能力和迁移能力的变化。　　 结果：初步研究发现重组质粒转染组与空质粒转染组相比,细胞迁移能力增强,细胞穿膜数分别为39.6±11.7和25.7±8.6,而细胞增殖能力并没明显变化。　　 结论：初步证实了C14orf166能促进肿瘤细胞的迁移,为进一步研究c14orf166的功能奠定了基础。