目前有机污染物在环境中广泛分布,尤其是持久性有机污染物( Persistent organic pollutions,POPs)对水环境的污染日益严重。我国水环境皆受到不同程度POPs的污染,污染种类以邻苯二甲酸酯类(Phthalatic acid esters, PAEs)和多环芳烃类(Polycyclic aromatic hydrocarbon, PAHs)尤为突出。人群可能同时长期低剂量暴露于这两类污染物,因此评价这两类化合物的联合作用对人类健康的影响很有必要。邻苯二甲酸二丁酯(Di-n-butyl phthalate,DBP)和苯并(a)芘(Benzo(a)pyrene, BaP)分别是这两类化合物中典型和具有代表性的污染物。虽然已有研究表明这两种化合物均具有雄性生殖发育毒性,但迄今为止未见有这两种物质联合作用下的生殖毒性研究报道,尤其是低剂量长期暴露的生殖毒性。既往研究表明,睾丸Leydig细胞是这两种化合物的主要靶细胞,可以影响睾酮的合成和分泌。本课题以DBP和BaP作为受试物分别代表PAEs和PAHs,以青春期雄性SD大鼠作为研究对象,采用亚慢性染毒方式,给予较低剂量的DBP和BaP,建立大鼠长期低剂量暴露模型;聚焦于观察DBP和BaP单独或联合染毒对青春期大鼠睾丸及Leydig细胞形态、结构和功能的影响。此外,Leydig细胞合成睾酮涉及多种调节因子和合成酶,因此,本研究采用Realtime-PCR、Western blot等手段检测与睾酮合成密切相关的胆固醇跨膜转运调节因子、睾酮合成关键酶、睾酮合成分泌调节激素受体、以及相关的调节因子在转录水平或翻译水平的变化以探讨相关机制,旨在增进对此类环境内分泌干扰物雄性生殖毒性及其机制的了解,为进一步深入研究奠定基础。实验方法1.实验动物及分组情况4-5周龄健康雄性SPF级SD大鼠168只,体重(89±17)g,由第三军医大学实验动物中心提供。按随机数字法随机分为7组(每组24只),即溶剂对照组(玉米油)、DBP低剂量组(50mg/kg)、DBP高剂量组(250mg/kg)、BaP低剂量组(1mg/kg)、BaP高剂量组(5mg/kg)、DBP+BaP低剂量联合组(50mg/kg DBP+ 1mg/kg BaP)、DBP+BaP高剂量联合组(250mg/kg DBP+ 5mg/kg BaP)。2.染毒方式及取材隔日染毒,等体积灌胃,灌胃体积2ml/kg,连续染毒90d。每天观察动物一般状况,每周称量体重1次,分别于染毒后30d、60d和90d,各组随机选取大鼠8只处死。分别取材用于检测各项指标。采集股动脉血,分离血清,采用放射免疫分析法测定血清睾酮(T)含量。采血后大鼠颈椎脱臼处死,立即剖取睾丸、附睾、心、肝、脾、肾,除去上述器官周围的脂肪结缔组织,吸尽脏器表面血液后,用电子天平称重,计算脏器系数,脏器系数以脏器重量(g)与体重(g)之比表示。睾丸称重后于冰上迅速切分为约50-100mg的小块,分装于冻存管中液氮保存。每组随机选取3个液氮冻存睾丸样本,用Realtime-PCR法检测睾丸胰岛素样因子3 (Insl3)、黄体生成素受体(LHR)、外周苯二氮卓受体(PBR)mRNA表达。每组随机选取3个液氮冻存睾丸样本,用Western blot法检测睾丸类固醇合成急性调节蛋白(StAR)、细胞色素胆固醇侧链裂解酶(P450scc)、3β-羟甾脱氢酶(3β-HSD)、17β-羟甾脱氢酶(17β-HSD)、转化生长因子α(TGF-α)和胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)的蛋白表达。睾丸称重后每组选取3只大鼠的右侧睾丸,置于4%多聚甲醛固定液中固定,72h后常规石蜡包埋切片,HE染色,光镜下观察曲细精管和间质的组织病理学变化。每组随机选取3只大鼠的左侧睾丸,取材后迅速固定于2.5%的戊二醛,然后进行梯度酒精脱水、环氧树脂渗透、包埋、超薄切片,醋酸铀和柠檬酸铅染色,于透射电镜下观察超微结构的改变(TECNAI-10, Philip,荷兰)。3.统计学分析:数据经SPSS13.0统计软件处理,实验数据均以均数±标准差( x±s)的形式表示,组间均数差异的显著性比较采用单因素方差分析。结果与讨论一、邻苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘对大鼠生长发育及睾丸形态学的影响1.对体重和脏器系数的影响DBP单独染毒、BaP单独染毒以及DBP和BaP联合染毒在本研究的染毒剂量下未对大鼠一般生长发育情况和体重增长有明显影响。对大鼠睾丸、心脏、脾脏无明显毒性作用;1 mg/kg和5mg/kg BaP染毒60d可以使附睾系数比对照组下降(P<0.05);250mg/kg DBP染毒90d可升高肝脏系数(P<0.05),5mg/kg BaP染毒90d可降低肝脏系数(P<0.05);5mg/kg BaP染毒30d,以及50mg/kg DBP+ 1mg/kg BaP低剂量联合染毒30d都可使肾脏系数下降(P<0.05);250mg/kg DBP+ 5mg/kg BaP高剂量联合染毒60d使肾脏系数增高(P<0.05)。提示BaP对附睾的影响更明显,附睾可能是BaP的靶器官;肝脏、肾脏可能也是DBP和BaP的主要靶器官之一, DBP和BaP对肝、肾可能也有潜在毒性。见表1。2.对睾丸及Leydig细胞形态学的影响光镜下未观察到各染毒组睾丸形态有明显病理改变;电镜下各染毒组染毒90d均可引起大鼠睾丸Leydig细胞超微结构发生不同程度的变化,主要是线粒体、滑面内质网扩张,也可见核周隙增宽,髓样变,核固缩,染色质边集,细胞器固缩,密度增高,线粒体固缩。二、邻苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘对Leydig细胞激素合成的影响1.对血清睾酮的影响50mg/kg DBP染毒30d可升高血清睾酮含量(P<0.05),推测低剂量DBP染毒可能存在低剂量兴奋效应;1 mg/kg BaP染毒60d、5mg/kg BaP染毒30d-60d、50mg/kg DBP+ 1mg/kg BaP低剂量联合染毒30d可升高血清睾酮含量(P<0.05)。提示≤5mg/kg BaP染毒30d-60d可以干扰睾酮的合成,可能BaP在此染毒剂量也有低剂量兴奋效应。见表2。2 .对睾丸Insl3 mRNA表达的影响高、低剂量DBP和BaP单独染毒以及联合染毒30d、60d、90d都能使睾丸Insl3 mRNA的表达下降(P<0.01)。提示转录水平的Insl3比睾酮对低剂量DBP和BaP更敏感,青春期亚慢性暴露于低剂量DBP和BaP可影响Leydig细胞的功能。见表2。三、邻苯二甲酸二丁酯和苯并(a)芘对Leydig细胞睾酮合成的影响机制探讨DBP和BaP单独染毒以及联合染毒30d、60d、90d对胆固醇跨膜转运调节因子、睾酮合成关键酶、睾酮合成分泌调节激素受体、以及相关的调节因子在转录水平或翻译水平的影响结果总结于表3。1.对胆固醇跨膜转运调节因子的影响DBP和BaP单独染毒以及低剂量联合染毒60d对PBR基因表达的影响主要是下调(P<0.01;P<0.05);高剂量联合染毒60d都是增强PBR的基因表达(P<0.01)。提示DBP和BaP单独以及联合染毒都对PBR的基因表达有影响,但是60d睾酮升高可能与PBR的上调或下调无关。DBP和BaP染毒60d使StAR蛋白表达增强(P<0.01),与睾酮水平升高一致,提示StAR蛋白表达升高可能在睾酮升高中发挥作用,是致睾酮升高的可能机制之一。2.对睾酮合成关键酶的影响DBP和BaP单独染毒以及联合染毒60d对P450scc蛋白表达的影响无统计学意义。提示睾酮升高可能与P450scc蛋白无关。5mg/kg BaP单独染毒30 d使3β-HSD蛋白表达增高(P>0.05),提示3β-HSD可能与5mg/kg BaP染毒30 d睾酮升高有关。250mg/kg DBP染毒60d可使17β-HSD蛋白表达升高(P<0.01);1mg/kg BaP染毒90d使其下调(P<0.01)。提示BaP染毒30 d引起睾酮升高可能没有17β-HSD的参与。3.对激素受体和相关调节因子的影响DBP和BaP单独染毒以及联合染毒都可使LHR mRNA表达下降(P<0.01);提示LHR在转录水平对DBP和BaP的毒性敏感,但是LHR基因表达的下降可能并非染毒60d血清睾酮升高的原因,DBP和BaP对睾酮的影响与受体调节途径无关,可能有非依赖LH通路的作用。50mg/kg DBP和1mg/kg BaP染毒30d、60d都使TGFα蛋白表达增高(P<0.01),5mg/kg BaP以及高、低剂量联合染毒30d都上调TGFα蛋白表达(P<0.01)。提示睾酮升高与TGFα蛋白表达上调一致,推测可能BaP通过增加TGFα的表达来调节睾酮。染毒组对IGF-Ⅰ蛋白表达的影响,30d、60d主要是上调(P<0.01;P<0.05),90d时下调(P<0.01;P<0.05)。BaP组染毒60d IGF-Ⅰ蛋白表达上调与睾酮升高一致,说明IGF-Ⅰ蛋白表达上调可能是本研究中DBP或BaP导致睾酮升高的机制之一。4. DBP和BaP高低剂量联合染毒对各观察指标的联合作用总结于表4。DBP和BaP联合染毒可发生交互作用,主要表现为拮抗,其次是协同,少数呈现非交互作用-相加。结论亚慢性DBP和BaP单独或联合暴露可对青春期SD雄鼠产生不利影响,不同的染毒时间产生不同程度的有害效应。BaP染毒可引起附睾、肝脏、肾脏系数改变,对这几个器官有潜在毒性。BaP染毒60d可使睾酮升高,推测StAR、3β-HSD、TGFα、IGF-Ⅰ蛋白的上调与其作用机制有关。50mg/kg DBP染毒60d升高血清睾酮,可能是DBP的低剂量兴奋效应,TGFα在其中可能发挥重要作用。由于联合作用主要表现为拮抗,因此本研究中染毒剂量下DBP和BaP联合染毒未见比单独染毒明显的毒性效应。本研究观察到血清睾酮主要是升高而并非下降,分析原因可能主要与染毒剂量和暴露年龄有关。一是本研究染毒剂量相对较低,可能出现低剂量兴奋效应;另外大鼠并非宫内暴露,而是青春期才开始暴露,因此没有宫内暴露敏感。DBP和BaP的联合毒性作用及机制还有待进一步验证和深入探讨。