耻垢分枝杆菌(M.Smegmatis)诱导巨噬细胞凋亡及microRNA表达变化的研究

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目的:耻垢分枝杆菌Mc2155株感染小鼠RAW264.7巨噬细胞系,观测细胞凋亡及microRNA29a、microRNA125b、microRNA146a、microRNA155的表达情况,探讨细胞凋亡及microRNA在巨噬细胞抗结核分枝杆菌中所发挥的作用。  方法:不同MOI(1、10)耻垢分枝杆菌Mc2155感染RAW264.7后,稀释平板法检测不同时间点细菌的细胞内增殖情况(CFU);流式细胞术(ANNEXIN V/PI双染法)检测细胞凋亡情况;ELISA检测细胞培养上清中与凋亡相关的炎症因子TNF-α、IL-1β的分泌水平;Real-time PCR检测细胞中炎症因子(TNF-α、IL-1β、iNOS、Arg-1)、自噬相关基因(atg5、atg7、atg12)、microRNAs(miR29a、miR125b、miR146a、miR155)的表达水平。  结果:  1.耻垢分枝杆菌MC2155感染后,各时间点MOI=1实验组的胞内菌量均小于MOI=10实验组;MOI=1实验组在早期胞内菌量无明显变化,6h到24h缓慢增长;MOI=10实验组,0h到12h胞内菌的增殖无明显波动,24h观察到其急剧增加。  2. Mc2155感染后,与对照组相比,MOI=1组在感染后期(24、48h)两组间差异有统计学意义;MOI=10组在6h、24h与对照组之间的差异有统计学意义。  3. TNF-α和IL-1β的蛋白水平检测结果:MOI=1组在6、24、48h水平均高于对照组,MOI=10组每个时间点都比其他两组水平高,差异均具有统计学意义;但是在上清中三个组均未检测到IL-1β。被感染的细胞胞内TNF-α的mRNA水平在6、12、24h均有上升,48h恢复到正常水平;MOI=1组在感染后24小时其IL-1βmRNA水平上调为对照组的4倍,MOI=10组IL-1βmRNA一直为高水平表达,在24h甚至是对照组的93.9倍;同时还检测了另外两个炎性因子iNOS和Arg-1的mRNA水平,结果提示MOI=1组从12h开始其iNOS mRNA水平逐渐上调,MOI=10组在6h时上调,12h变成轻微下调,24h和48h又为上调,其中24h的表达水平最高;MOI=1组在12h其Arg-1水平上调,在48h出现轻微下调,MOI=10组在48小时发生了并不明显的水平下调。  4.细胞感染后MOI=1组在早期atg5、atg7、atg12的mRNA水平均上调,12h时atg5水平进一步升高,但atg12却下调至正常水平以下,48h时atg7和atg12水平再次上调;MOI=10组在感染6、12h时atg5水平上调,6、24h时atg7水平上调,12h时atg12水平轻微下调。  5.受感染后 RAW264.7表达相应 microRNA的情况:其中,MOI=1组 miR29a在6小时和12小时出现上调,随后下调至正常水平以下,MOI=10组在6小时出现上调,12小时上调显著,随后恢复至正常水平;miR125b与miR146a情况一致,MOI=1组均未观察到起水平的变化,仅在12小时观察到MOI=10组其表达水平上升;miR155在MOI=1组48小时发生下调,MOI=10组12小时其水平上调。  结论:当耻垢分枝杆菌MC2155感染RAW264.7后,自噬在早期发挥了抑制感染的作用;随着时间的延长,microRNA29a和microRNA146a的高表达促进了细菌的增殖,与此同时,microRNA155表达水平上调,诱导细胞分泌TNF-α,促进细胞发生凋亡、促进炎症的发生以抑制细菌的增殖;另外,巨噬细胞来源不同,对耻垢分枝杆菌MC2155的敏感性不同,细胞发生极化的方向也不同。
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