辅酶A OsECH1基因抗水稻潜根线虫功能分析

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水稻是当前世界上最重要的粮食作物之一,是世界上一半以上人口的主粮。据预测,到2030年,为了满足人口增长需要,水稻产量需要增加25%。水稻潜根线虫是一类寄生于水稻根部,具有迁移性,广泛分布于各类水稻田,严重危害水稻的内寄生线虫。水稻潜根线虫病也是江西省水稻生产上危害严重的病害之一。为了防治该病害,培育并种植相应的抗病品种是较为经济、有效的措施。目前对于水稻潜根线虫的研究较少,挖掘水稻与潜根线虫互作机制并解析其内在的抗性分子机理,对提高水稻对潜根线虫病的抗性,减轻病害损失具有重要的意义。为此,实验室前期对来源于世界各地的560份水稻种质进行了抗水稻细尖潜根线虫的鉴定,从中筛选到高抗和高感的水稻种质,并通过RNA-seq技术获得抗感品种接种前后的转录组数据,比较后筛选出差异表达上调基因OsECH1。本实验通过克隆基因OsECH1全长序列,利用同源重组技术构建重组表达载体,得到过表达载体pCAMBIA1302-OsECH1、RNAi载体pBWA(V)HS-OsECH1、原核表达载体pET28a-OsECH1。通过生物信息学分析可知该基因ORF全长1170bp,编码389个氨基酸;该蛋白可能为跨膜蛋白,属于PLN02874超家族,该家族主要是烯脂酰辅酶A水合酶和3-羟基异丁酰辅酶A水解酶,参与脂肪酸β-氧化反应。利用农杆菌转化获得转基因水稻,经qRT-PCR验证该基因在不同处理水稻中的相对表达量,实验结果证明该基因主要在根部表达,但经线虫侵染后,根部表达量下降,叶部表达量上升。最后利用IPTG诱导OsECH1蛋白表达,可溶性蛋白在0.6 mM IPTG 18℃诱导14 h表达量最高。在纯化过程中,200 mM咪唑洗脱时洗脱量最大。通过与根总蛋白互作进行Pull-down实验,结果证明存在6个蛋白与目的蛋白互作。综上所述,在水稻遭受线虫侵害时,该基因的互作机制网络较复杂,主要是在水稻叶片中发挥作用。本实验为进一步阐明该基因作为水稻抗潜根线虫基因的分子机制奠定基础。
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