铁皮石斛(Dendrobium officinale Kimura et Migo)为兰科(Orchidaceae)石斛属(Dendrobium Sw.)药用植物,药用功效主要来自石斛多糖和生物碱等成分。由于在自然条件下,铁皮石斛萌发率低,生长缓慢,再加上人们长期掠夺式的采挖,生境遭到严重破坏,导致野生资源急剧紧缺。为了保护野生资源和满足市场需求,铁皮石斛人工种植规模不断扩大,已成为解决铁皮石斛资源紧缺的主要途径。但是,在人工种植过程中,种质来源复杂,导致铁皮石斛品质差异较大。因此,亟需建立一种有效可靠的方法用于铁皮石斛遗传多样性、居群结构分析及居群间的杂交种质鉴别研究,为保护其野生资源和培育优良品种提供理论依据。本研究首先根据铁皮石斛多糖和生物碱合成相关基因(PEPC、UGP和PAL)设计三对固定引物,同时结合18个随机引物,开发TRAP分子标记。采用正交试验法对影响TRAP-PCR反应的主要影响因素(dNTP、Mg2+、模板浓度、Taq DNA聚合酶和引物浓度配比)进行优化,获得最佳TRAP-PCR反应体系,并对TRAP引物进行筛选,获得多态性高、重复性好的引物组合。结果显示,最优TRAP反应体系(20μL 体系)为:dNTP(2.5 mmol·L-1)1.0μL,MgCl2(25 mmol·L-1)1.2 μL,Taq DNA聚合酶0.9 U,随机引物(2 mmol·L-1)1.5μL,固定引物(2 mmol·L-1)2 μL,模板DNA浓度为20 ng。此外,成功筛选出8对稳定性好、重复性高的TRAP引物,能够有效用于铁皮石斛遗传多样性分析。其次,本研究利用筛选出的8对TRAP引物对9个铁皮石斛野生居群进行遗传多样性和居群结构分析。结果表明,8对TRAP引物共扩增出148个条带,其中130个多态性条带,占87.84%,铁皮石斛居群内具有较高的遗传多样性(H=0.4125,I=0.5985),其中贵州三都(SD)铁皮石斛居群的遗传多样性水平最高;居群间存在中等水平的遗传分化(Gs,=0.4706)和较低水平的基因流(Nm=0.5625);聚类分析结果表明,9个铁皮石斛野生居群分为四大支,PCA分析结果和UPGMA聚类结果相一致,Mantel test检测表明遗传距离和地理距离之间没用明显正相关性(r=0.5496;p>0.05)。此外,本研究以云南广南(GN)铁皮石斛为共同亲本,分别与江西南丰(NF)和贵州三都(SD)铁皮石斛亲本进行正反杂交,产生的杂交后代分别为H1和H2。利用筛选出的7对TRAP引物对亲本及其杂交后代进行鉴别分析。结果显示,在杂交后代中均能检测到父母本特征性条带和新产生条带,能够将亲本及其杂交后代准确鉴别开。聚类分析表明,正反杂交后代均先与GN铁皮石斛亲本聚为一支,再与另一亲本聚为一支,体现了杂交后代与云南广南铁皮石斛的亲缘关系较近。因此,利用TRAP分子标记分析铁皮石斛野生居群遗传多样性水平及其杂交后代鉴别研究,有利于选择优质居群进行人工培育,实现了杂交后代的早期鉴别,提高种质质量的控制,为改善铁皮石斛品质提供理论依据。