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谷胱甘肽(glutathione,y-L-glutamyl-L-cysteinyl-glycine,GSH)是一种由谷氨酸、半胱氨酸和甘氨酸缩合而成含巯基的活性三肽,有还原型(G-SH)和氧化型(G-S-S-G)两种形式,只有前者有活性。由于谷胱甘肽含有活泼的巯基,具有许多生理功能,在食品、化妆品以及医药行业都被广泛应用。随着对GSH的了解逐渐加深,GSH的市场需求量也逐渐增大。因此,GSH的工业化生产则显得尤为重要。目前,GSH生产方法主要有溶剂提取法、化学合成法、微生物发酵法和酶法四种。其中酶法是指利用酶来催化三种氨基酸合成GSH的方法。在大多数细胞及革兰氏阴性菌中,GSH的酶法合成由两步构成,由γ-谷氨酸半胱氨酸合成酶(γ-GCS,大肠杆菌中由基因gshA编码,在酵母中由gshⅠ编码)和γ-谷胱甘肽合成酶(GS,大肠杆菌中由gshB编码,在酵母中由gshⅡ编码)分步催化,然而当GSH含量过多时,会与γ-谷胱甘肽合成酶结合,造成中间产物的积累从而降低GSH产量。近年来,在一些细菌中发现了一种能依赖ATP,且同时具有以上两种酶活性的新型酶,即新型双功能谷胱甘肽合成酶,GshF,且据有已有文献报道,来源于大部分细菌的GshF对GSH不敏感。因此,本研究的主要内容:1)首先根据NCBI中已有的gshFSA的序列与pPIC9K、pET-28a上多克隆位点设计两对引物,用高保真PCR的方法从Streptococcus agalatiae中克隆出目的基因gshFSA。再分别构建重组表达载体pPIC9K-gshFSA和pET28a-gshFSA,然后分别转化到GS115和BL21中,通过G418抗性筛选出高拷贝转化子,再进行诱导表达,利用SDS-PAGE技术检测发酵液中GshFSA。用Bradford法分别测粗酶液中的总蛋白含量,其中pPIC9K-gshFSA/GS115发酵液中的总蛋白含量为0.46mg/mL,pET28a-gshFSA/1BL21 发酵液中总蛋白含量为 1.46mg/mL;2)对重组酵母pPIC9K-gshFSA/GS115诱导表达中的甲醇诱导浓度、诱导温度、发酵液pH进行单因素梯度优化。当诱导温度为30℃,GshF表达量最大;当甲醇诱导浓度为2%时,GshF表达量最大;当诱导pH为6.0时,GshF表达量最大;再设计正交实验确定这些因素的最佳组合以便获得最大产量的GSH,结果显示,当甲醇诱导浓度为2.5%、诱导温度为30℃、诱导pH为6.0时,经重组酵母表达的GshF酶活最高,为9.1U/mL。3)对重组工程菌pET28a-gshFSA/BL21诱导表达的温度、诱导时机和诱导剂浓度进行优化。当重组大肠杆菌培养5.5h后.再加入诱导剂IPTG诱导培养7h后所得GshF酶活最高,为12.23U/mL;当诱导温度为34℃时,表达所得酶活最高,可为12.02U/mL;当诱导剂浓度为0.3mmol/L时,诱导表达的GshF酶活最高,为3.91U/mL。还选择了所含酶活最高的菌体进行超声破壁处理,发现破壁后蛋白含量提高了4倍,酶活提高了3倍左右。