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宫颈癌是女性第二大恶性肿瘤,淋巴转移是其独立预后因素,也是宫颈癌患者死亡的主要原因。侵袭和转移是恶性肿瘤的主要生物学特征,寻找影响宫颈癌侵袭转移的相关分子标志物,探索其分子机制,将有助于宫颈癌转移的早期诊断及治疗。巨噬细胞移动抑制因子(Macrophage migration inhibitory factor, MIF)是许多炎症和免疫反应的重要调节因子,在肿瘤发生发展过程中发挥重要作用。但MIF促进肿瘤细胞浸润转移的具体作用机制及其通过何种途径影响宫颈癌细胞的生物学行为尚不完全清楚。本课题组前期研究发现MIF在宫颈癌细胞株Caski中高表达,在SiHa细胞中低表达,并发现MIF在宫颈癌细胞中通过自分泌调节细胞活性,通过旁分泌促进细胞的增殖分化、浸润及转移,MIF及其相关因子可能通过ERK/MAPK、PI3K/Akt等信号传导通路在早期宫颈癌浸润转移中起重要作用[3-5]。基于本课题组的前期研究,本研究利用基因重组技术,介导目的基因MIF转染至人宫颈癌SiHa细胞,检测MIF及其相关因子IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1的表达,以及对细胞增殖、侵袭迁移能力的影响,进而探讨MIF在宫颈癌浸润转移中的作用机制,以期为下一步宫颈癌的基因诊断和治疗提供良好的实验基础。目的：研究重组真核表达载体pEGFP-N1-MIF转染人宫颈癌细胞SiHa后对MIF及其相关因子IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1表达的影响,以及对SiHa细胞生物学特性的影响,探讨MIF在宫颈癌浸润转移中的作用机制。方法：1.利用真核表达载体pEGFP-N1构建重组真核表达载体pEGFP-N1-MIF,应用XhoI、BamHI双酶切及序列测定鉴定pEGFP-N1-MIF。2.采用脂质体法将重组真核表达载体pEGFP-N1-MIF转染至低表达MIF的SiHa细胞中,荧光显微镜下观察其转染情况。ELISA法检测各组细胞(转染重组质粒pEGFP-N1-MIF的实验组、转染空质粒pEGFP-N1的阴性对照组、未转染的空白对照组)上清液中MIF蛋白的表达；Real-time PCR及免疫细胞化学法检测各组细胞中MIF mRNA及蛋白的表达水平。3. Real-time PCR及免疫细胞化学法检测各组细胞中IL-8、NF-κB、Bcl-2、 CyclinDl mRNA及蛋白的表达水平；通过MTT、软琼脂集落形成实验、Boyden小室趋化实验、细胞划痕迁移实验观察MIF过表达对SiHa细胞生物学特性的影响。4.应用NF-κB抑制剂PDTC干预SiHa细胞,免疫细胞化学法检测MIF、 IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1的蛋白表达情况；MTT、软琼脂集落形成实验、Boyden小室趋化实验、细胞划痕迁移实验检测PDTC干预后SiHa细胞生物学特性的变化。结果：1.重组真核表达载体pEGFP-N1-MIF经双酶切后,琼脂糖凝胶电泳可见约4.7kb、348bp处两条清晰条带；序列测定结果与目的序列相同。2.转染6h后,转染pEGFP-N1-MIF的实验组和转染pEGFP-N1的阴性对照组细胞即可在荧光显微镜下观察到绿色荧光,且荧光强度随时间增加而逐渐增强,48h时荧光最亮；ELISA证实实验组细胞上清液中MIF表达均高于各对照组(P<0.05)；Real-time PCR及免疫细胞化学法证实实验组细胞中MIF mRNA和蛋白的表达水平均高于各对照组(P<0.05)。3. Real-time PCR及免疫细胞化学法检测结果显示：转染48h后,实验组细胞中IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1mRNA和蛋白的表达均明显增高,与阴性对照组、空白对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05);且MIF与IL-8、NF-κB、 Bcl-2、CyclinD1mRNA和蛋白之间存在正相关(P<0.05),NF-κB与IL-8、Bcl-2、 CyclinD1mRNA和蛋白之间存在正相关(P<0.05), IL-8与Bcl-2、CyclinDl mRNA和蛋白之间也存在正相关(P<0.05)。MTT法检测结果显示：实验组与阴性对照组、空白对照组相比,转染后SiHa细胞的增殖作用明显增强(P<0.05),且随转染后培养时间延长,促增殖作用更加明显；而阴性对照组与空白对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。软琼脂集落形成实验结果显示：实验组与各对照组相比,克隆形成数明显增多(P<0.05),而阴性对照组与空白对照组间无显著差异(P>0.05)。Boyden小室趋化实验结果显示：实验组、阴性对照组、空白对照组细胞在每个视野的平均穿膜细胞数分别为(268.930±7.923)个、(108.070±5.271)个、(111.930±4.464)个。实验组与各对照组相比,差异均有统计学意义(P<0.05)；而阴性对照组与空白对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。划痕迁移实验显示实验组细胞迁移率明显高于各对照组,差异有统计学意义(P<0.05),而阴性对照组与空白对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。4. NF-κB抑制剂PDTC干预SiHa细胞后,MIF.IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1的蛋白表达受到明显抑制；且MIF与IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1蛋白表达存在正相关(P<0.05), NF-κB与IL-8、Bcl-2、CyclinD1蛋白表达存在正相关(P<0.05),IL-8与Bcl-2、CyclinD1蛋白表达也存在正相关(P<0.05)。MTT法结果显示：运用PDTC在不同浓度、不同时间干预下,其对SiHa细胞的抑制率呈时间-剂量关系,100μmol/L PDTC明显抑制SiHa细胞的增殖活性,且在72h时其抑制作用最为明显。软琼脂集落形成实验发现,细胞培养3天后,在相差显微镜下观察发现实验组细胞有小集落形成,而加PDTC抑制剂组未发现集落形成。随培养时间延长实验组集落逐渐增多增大,且分布于不同层面；而加PDTC抑制剂组集落明显变小,并且随着PDTC浓度的增加,集落形成数逐渐减少。Boyden小室趋化实验结果显示：随着PDTC浓度的增高,穿膜细胞数减少。细胞划痕迁移实验显示：细胞迁移率随抑制剂PDTC浓度的增加逐渐变小。100μmol/LPDTC干预pEGFP-N1-MIF-SiHa细胞后,划痕宽度无明显变化。结论：1.重组真核表达载体pEGFP-N1-MIF构建成功。2.转染重组真核表达载体pEGFP-N1-MIF后SiHa细胞中MIF过表达。3.MIF过表达可上调IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1的表达,并增强SiHa细胞体外增殖、侵袭迁移能力。4. PDTC明显抑制MIF、IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1的表达,并抑制SiHa细胞体外增殖、侵袭迁移能力。5.MIF与IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinDl之间,NF-κB与IL-8、Bcl-2、CyclinDl之间,IL-8与Bcl-2、CyclinD1之间均存在正相关,推测MIF可能通过NF-κB信号转导通路调节IL-8、Bcl-2、CyclinD1等下游因子的基因表达,而IL-8又可与相应受体结合,激活NF-κB通路促进Bcl-2、CyclinD1等下游因子的基因表达,从而促进宫颈癌的侵袭和转移。综上所述,MIF过表达可上调IL-8、NF-κB、Bcl-2、CyclinD1的表达并增强SiHa细胞增殖、侵袭迁移能力,这可能与NF-κB信号转导通路相关,但有待进一步证实。本实验可能为研究早期宫颈癌浸润转移的分子机制提供线索,为早期基因诊断提供一个有效的标志物。