[研究背景和目的]研究背景：在美国,结直肠癌是男性和女性第三大最常见的癌症,同时也是第三大癌症死亡的原因。结直肠癌患者的生存和预后取决于肿瘤的检测阶段。不幸的是,约50%的患者在诊断时已有区域或远处转移。虽然近年来对结直肠癌的诊断与外科治疗均取得长足发展,但该病的术后5年生存率仍徘徊在50%-65%。究其原因是由于结直肠癌早期诊断率低,术后易复发并向其他脏器组织侵袭转移。因此,结直肠癌的治疗已成为世界范围内研究的焦点。结直肠癌转移是一个非常复杂的过程,其发病机制目前尚不完全清楚,诊治的方法未达到理想的效果,尤其是对于晚期结直肠癌患者,治疗手段仍然不多。因此,人们现在正在寻找新的诊治方法。中医药已在肿瘤治疗领域中表现出独特的优势,在杀伤肿瘤细胞的同时,可以减轻化疗和放疗不良反应。蟾毒灵是从中药蟾酥中分离提取的活性单体物质,蟾毒灵对多种肿瘤具有显著的抗肿瘤效果,然而,因为其具有较大的毒性、难以溶于水、半衰期短等缺点,限制了其在临床上的应用。研究表明,用纳米复合材料包载蟾毒灵可以克服以上的缺点。利用纳米技术研制的靶向纳米药物,使药物具有了肿瘤靶向性,在肿瘤组织内滞留缓慢释放,可以提高药效,并可以减少原有的药物副作用。普朗尼克(Pluronic)属于两亲性三嵌段的共聚合物(聚氧乙烯-聚氧丙烯-聚氧乙烯),结构中有亲水链(聚氧乙烯)和疏水链(聚氧丙烯),具有较好地生物组织相容性和可降解性,已被作为食品和医用敷料的人工聚合物材料之一。但Pluronic胶束纳米粒在溶液中极不稳定,很容易被稀释而自行降解,这就限制了它的应用范围。聚乙烯亚胺(polyethylenimine, PEI)是一类阳离子聚合物,含有大量氨基结构,可作为一种非病毒基因转染系统。低分子量的PEI可以作为交联剂与Pluronic结合,能提高Pluronic聚合物复合材料(pluronic-polyethylenimine, Pluronic-PEI)的稳定性,并大大提高了共聚物所形成的胶束稳定性,可以用于制备药物的纳米载体。目的：制备具有靶向作用和缓释作用的包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊,并建立质量评价标准；测定该纳米微囊体外释放和靶向分布规律,探讨其对裸鼠结直肠癌的抑制作用,以揭示包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊的药理学机制。[研究方法]1.包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊制备方法：选用低分子量PEI (Mw=2000)作为交联剂进行交联,改善普朗尼克的热力学不稳定性,采用超声乳化法制得包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊。2.对包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊的理化性质进行研究：透射电子显微镜观察纳米微囊表征及粒径分布；测定包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊的包封率和载药量,绘制体外释放曲线,检测空白纳米微囊细胞毒性。3.包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊靶向分布研究：选用罗丹明B(Rb)作为荧光探针,将其包裹在纳米微囊中,在激光共聚焦显微镜下观察细胞中所摄入纳米微囊的分布情况。4.包载蟾毒灵的Pluronic-PEI纳米微囊对裸鼠结直肠癌的抑制作用：建立HCT116肠癌裸鼠肿瘤模型,随机分为对照组、空白纳米微囊组、蟾毒灵组、包载蟾毒灵纳米微囊组、奥沙利铂组,尾静脉给药。比较治疗前后各组裸鼠的体重变化、活体靶向荧光成像以及全身转移情况。[研究结果]1.包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊的制备及理化性质：通过化学交联改性剂交联,克服了普朗尼克的热力学不稳定性,制备的纳米微囊粒径大小均匀,外形圆整,粒径最小30nm,最大80nm,平均65±0.214nm, Zeta电位为5.87±0.42mV。当蟾毒灵投药量为0.4mg时,载药量最高。2.包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊的体外释放明显较游离蟾毒灵缓慢。在4小时左右,游离蟾毒灵的释放率已经超过了60%。而纳米微囊在前5小时表现出突释相特征,累计释放量达到40%-50%,5小时之后,纳米微囊的体外累积释放明显放缓,在32小时时,蟾毒灵的累积释放量达70%-80%。3.药物靶向分布研究：在HCT116细胞内,载药纳米微囊组罗丹明B的红色荧光明显强于游离罗丹明B组,且主要分布在细胞浆内,只有少量分布在细胞核内,而游离罗丹明B组细胞核内基本观察不到红色荧光。4.包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊对裸鼠肠癌的抑制作用：治疗后包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊与等剂量蟾毒灵相比,对裸鼠肠癌肿瘤生长、转移的抑制作用更加明显,且裸鼠生存质量更高。[研究结论]1.本研究采用超声乳化法建立了包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊的制备方法和质量评价标准。2.与游离蟾毒灵相比,包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊显示出明显的缓释特点,随着时间的延长逐步释放出药物,在32小时累积释放达70-80%。3. Rb-Bufalin-Pluronic-PEI纳米微囊的细胞摄取效率比游离的蟾毒灵的摄取显著提高,说明纳米微囊能更有效地靶向肿瘤,具有较好的肿瘤靶向作用。4.空白纳米微囊细胞增值率≥80%,说明基本无细胞毒性。5.包载蟾毒灵Pluronic-PEI纳米微囊对肠癌的生长、转移有明显抑制作用,对裸鼠肠癌具有较好的治疗作用,并能显著提高荷瘤裸鼠的生存质量。