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根据GenBank已公布的禽流感病毒H5、H7亚型血凝素蛋白(HA)编码基因，使用DNAStar分析这两个亚型不同毒株间的同源性，选定几个同源性高的区域，之后H5以A/Chicken/Jilinl/hk/2004(H5N1)、H7以A/avian/NY/70411-12/00(H7N2)为参考株，DNAStar来分析两个亚型选定的区域在这两个参考株内的同源性，最后分别确定要扩增的靶区域。严格控制引物自身的二聚体及引物间的二聚体和发卡结构，最后确定了两对引物P51P52和P71 P72。Trizol法提取RNA，RT-PCR成功扩增出H5、H7的目的基因分别为427bp和228bp。扩增片段与载体pMD18-T连接，将连接产物转化大肠杆菌的感受态细胞，重组质粒经PCR鉴定后进行测序，同时也将PCR产物进行测序。BlastN分析结果显示H5、H7的各自扩增的目的片段扩增产物与GenBank公布的H5、H7亚型血凝素蛋白编码基因同源性在99％～87％之间，从而分子水平上确定建立的RT-PCR反应的特异性。
经优化单项RT-PCR，H5亚型51℃～855℃退火温度下扩增效果好，H7亚型55℃情况下扩增效果较好，检出率高，所以二者在55℃下有共同反应程序。模板量为2.0μl时二者的扩增效率高且效果好。H5的合适引物浓度为0.16μM～0.96μM扩增效果好，H7的合适引物浓度在0.32μM～0.96μM时扩增效果好。Mg2+浓度为1.5m M时，两种亚型的扩增效果均较好。最后建立了单项最佳的RT-PCR反应体系组成与反应条件。
RT-PCR检测反应的敏感性，结果显示H5的敏感度为10-4，H7的敏感度为10-2。
RT-PCR检测猪温病毒、鸡传染性支气管炎病毒、鸡传染性法氏囊病毒、鸡传染性喉气管炎病毒、鸡新城疫病毒及H9亚型禽流感病毒，扩增结果均为阴性。
在建立的最适单项RT-PCR反应体系与条件基础之上，确定二联RT-PCR二者合适的引物浓度，H5浓度为0.32μM，H7浓度为0.96μM时二者扩增效果好。
二联RT-PCR检测10倍梯度稀释的单项模板，H5的敏感性为10-3，比单项RT-PCR敏感度降低了一个稀释度；H7的敏感性为10-2，与单项RT-PCR敏感度一致。二联RT-PCR检测10倍梯度稀释的H5、H7混合反转录产物，H5的的敏感性为10-3，H7的敏感性10-2，与二联检测单项模板的敏感性一致。
实验结果显示建立的二联RT-PCR能够敏感、快速的检测H5和H7亚型禽流感病毒。