有机磷农药其主要成分是有机磷化合物,是一种乙酰胆碱结构类似物,可以高效的抑制昆虫的乙酰胆碱酶,从而起到消灭害虫的目的,因其具有高效、快速、低成本的特点被广泛应用,其对农业发展进步做出了巨大的贡献,为人类的粮食安全提供了强有力的保障。但是有机磷农药作为一种广谱性的神经毒素杀虫剂,对人类和动物的神经系统也有毒害作用,在自然界中不易降解,且在生物体内具有富集作用。多年来,由于有机磷农药在农业中的广泛应用,其造成的污染也日益严重,危害着人类生命安全及发展。随着人们生活水平的提高,对食品安全日益重视,为了降低有机磷污染,目前已开发多种处理有机憐污染物的方法,但存在着能耗高、不经济、造成二次污染等问题,不适合应用和推广。有机憐水解酶（EC3.1.8.1）作为一种天然的生物大分子,是一种磷酸三脂酶可以有效降低有机磷化合物毒性的目的,并且避免二次污染,且具有专一性强、效率高、经济、节能的特点。本课题中将一种来源于Pseudomonaspseudoalcaligenes的有机憐水解酶基因Ophc2,不改变有机磷水解酶氨基酸编码序列的前提下对编码该蛋白的核苷酸序列按照P.pastoris的密码子偏爱性进行优化及合成ophcM。将经密码子优化过的合成基因片段ophcM装载到毕赤酵母表达载体pHBM905A-BDM中。为提高产量,通过生物砖的方法在体外构建多拷贝,获得含有不同拷贝数的重组质粒,并分别命名为pHBM905A-ophcM 1,pHBM905A-ophcM2,pHBM905A-ophcM 3,pHBM905A-ophcM4。将经过验证的多拷贝重组质粒通过转化的方法分别转入毕赤酵母GS115菌株中,通过筛选及荧光定量PCR的方法对重组菌株的拷贝数进行确定,获得含有不同拷贝数的重组菌株,将含有不同拷贝数的重组菌株分别命名为ophcM-1C、ophcM-2C、ophcM-3C、ophcM-4C。本课题探究了拷贝数对表达量的影响,通过荧光定量PCR的方法测定不同拷贝数的重组菌株在转录水平上mRNA的表达差异,结果表明随着拷贝数的增加,体内的ophcM基因的mRNA水平也呈递增的趋势;通过测定产生的重组蛋白量衡量在翻译水平上的差异,在两拷贝的毕赤酵母菌株ophcM-2C表达量最高,但是随着拷贝数的增加,OPHCM的表达量有下降的趋势;说明提高拷贝数有助于提高重组蛋白的产量,但是拷贝数并不一定与表达量成正相关,高拷贝不一定会有高的表达量。将含有两拷贝有机磷水解酶基因的重组毕赤酵母菌株ophcM-2C接种到装有2-1基础盐培养基的5-1发酵罐中进行高密度发酵,重组菌株在28℃,pH 5.0条件下进行生物量的积累,在26℃,pH 5.0进行甲醇诱导表达,在经过144h诱导表达之后,蛋白浓度达到8.1 g/L,比活为12.85 U/mg。通过对发酵得到的酶液进行纯化,经历了多次探索,找到了一种既可以减少纯化次数提高得率又可以实现高效纯化的方法,目的蛋白回收率可达到70%左右,纯化倍数为2.8倍。对重组有机磷水解酶的性质分析发现,该酶最适反应温度是50℃,最适反应pH是11。进一步的研究发现该酶对有机溶剂和金属离子有一定的耐受性,并且Cd²⁺,Mg²⁺,Glycerine等表现出对该酶有一定的激活作用。本研究中首先将来源于假单胞菌的有机磷水解酶基因按照毕赤酵母对密码子的偏爱性进行优化,并通过部分重叠PCR的方法合成有机磷水解酶基因（OphcM）,然后转入毕赤酵母表达系统并实现重组酶（OPHCM）的表达。其次,为了提高重组酶的产量,本研究中基于限制性内切酶的性质,根据生物砖（Biobrick）的方法,通过在体外构建高拷贝重组质粒,并在酵母中进行表达。同时,在本课题中,我们探讨了拷贝数对重组基因在转录水平以及蛋白表达水平上的关系。通过对OPHCM酶学性质研究发现该酶具有较广的pH和温度范围,并对有机溶剂和金属离子有一定的耐受性,表明该酶适合在条件比较复杂的环境中工作,且发酵产量较高,本研究的一系列工作为该酶的广泛工业化应用奠定了技术基础。