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雌性哺乳动物的生育能力与卵巢卵泡的发育和闭锁紧密相关。作为卵泡的重要组成部分,颗粒细胞对于卵母细胞的存活和生长以及类固醇的合成分泌至关重要。miRNA作为转录后基因表达的负调控因子,通过与靶m RNA相互作用调节颗粒细胞的功能和凋亡。家兔是重要的经济动物及良好的动物模型,为繁殖母兔的选育和管理提供理论基础,并且关于miRNA在兔卵巢发育过程中的功能研究较少。在人类生殖系统疾病发展过程中,miR-106a-363簇的miRNA(miR)-18b起着重要作用。因此,本研究将探究miR-18b在类固醇激素合成过程中的表达及其对颗粒细胞增殖凋亡的影响。本试验以兔颗粒细胞为研究对象,通过过表达和抑制miR-18b,使用酶联免疫吸附测定(ELISA),CCK8细胞增殖检测方法,流式细胞术及Annexin V-FITC/PI染色,实时定量PCR(Real-time q PCR),双荧光素酶和蛋白印迹(Western Blot)等试验技术探究miR-18b对颗粒细胞功能的影响,并对miR-18b的靶基因进行了预测和验证。本试验对深入了解调节兔颗粒细胞类固醇激素的功能和机理方面的研究提供了新视角。结果如下:1.预测miR-18b的基本功能,发现兔miR-18b在进化上高度保守。使用生物信息学预测并分析miR-18b的直接靶标,发现miR-18b靶基因富集的信号通路在细胞增殖和凋亡等。这些结果大多与已知在卵巢发育,成熟和闭锁中起作用的信号通路相吻合。这为进一步探索miR-18b在卵巢颗粒细胞中的生物学功能提供了依据。2.本研究分离鉴定了兔颗粒细胞。然后,使用CCK-8法,流式细胞术检测了细胞增殖和周期,结果显示过表达miR-18b后,细胞周期停滞在S期之前,从而抑制了DNA合成和细胞增殖。运用Annexin V-FITC荧光检测结果表明,miR-18b能够促进颗粒细胞凋亡;并使用q PCR检测凋亡相关基因(Caspase-3,Bax和Bcl2)的表达,与凋亡检测结果一致。3.在过表达miR-18b后,使用ELISA检测到细胞培养基中E2表达量降低,但是P4合成没有受到显著影响。并使用q PCR检测激素合成相关基因(CYP19A1,CYP11A1和17B-HSD1)的表达量,结果表明miR-18b的沉默增加了E2生成相关基因的表达。4.本试验通过双萤光素酶检测验证了miR-18b直接靶向ESR1的3’UTR区。在体外培养的兔颗粒细胞中的功能分析表明,miR-18b的过表达导致ESR1 m RNA和蛋白水平降低,进一步证明了miR-18b和ESR1呈负相关表达模式。以上结果表明,miR-18b对兔卵巢颗粒细胞激素分泌和凋亡具有调控作用。过表达miR-18b会抑制颗粒细胞增殖,促进细胞凋亡。同时miR-18b可以充当负调节因子介导与E2合成相关酶的产生下调E2的水平。并且本研究还预测及鉴定了miR-18b的直接靶基因ESR1。研究结果对进一步了解miRNA影响卵泡发育提供了新的候选基因,对提高畜牧生产的经济效益具有重要意义。