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本研究以分离来源于中国健康人群肠道的益生菌为目的,以期获得更适合中国人肠道特点,拥有自主知识产权、具有独特的功能特性,安全性和生产性能达到应用水平的的菌株。
首先,从20份健康成人和10份一月龄婴儿的粪便中分离、纯化乳酸菌和双歧杆菌,通过细菌形态学技术和API鉴定技术对分纯菌株进行鉴定,共得到分属于7个种的19个纯化的潜在益生菌菌株。
纯化菌株分别在ptt2.O和胆汁盐浓度0.3%、pH3.O的条件下,进行耐酸和耐胆汁液的体外筛选,获得存活率大于1%的菌株15个。继而以肠癌细胞系HT-29为实验模型,以此15个菌株进行肠道吸附能力的体外筛选实验。结果表明,有7个菌株肠道吸附能力较好,其中嗜酸乳杆菌LA-SYO2、类干酪乳杆菌类干酪亚种LPP-SY33和长双歧杆菌.BL-SY3l对肠癌细胞HT-29的吸附能力较强。对此7个菌株进行降低胆固醇、抑制致病菌和幽门螺杆菌特性的体外研究表明,7个菌株普遍具有较强的同化胆固醇能力,其中4个菌株可脱除乳脂肪中50%以上胆固醇,可作为生产低胆固醇发酵乳制品的备选菌株。7个菌株对肠道致病菌抑制作用研究表明,各菌株耗尽上清液对志贺氏茵的抑制作用最明显,其次为沙门氏菌,而对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌抑制作用相对较弱。7个菌株的耗尽上清液对幽门螺杆菌的抑制明显高于对肠道致病菌的抑制效果,且抑制能力不存在乳酸依赖性,但具有浓度效应。
对7个入选菌株进行工艺筛选,包括抗冻干能力、与传统发酵剂菌株的配伍能力、贮存稳定性以及发酵产品的风味评价。结果表明,嗜酸乳杆菌LA-SY02,LA-SY26和长双歧杆菌BL-SY31具有较强的抗冷冻干燥的能力。嗜酸乳杆菌的3个菌株(LA-SY02,LA-SY26,LA-SY32)与嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的配伍能力较好。加入嗜酸乳杆菌LA-SYO2和鼠李糖乳杆菌LCR-SYO6制成的酸奶风味最好。
综合上述筛选结果,确定综合表现良好的长双歧杆菌BL-SY31和嗜酸乳杆菌LA-SY02两个菌株作为应用于产业化生产的备选菌株,并对其安全性包括耐药性和遗传稳定性进行评价。结果表明,嗜酸乳杆菌LA-SY02和长双歧杆菌BL-SY31都具有较低的耐药性;两个菌株未发现有害物质的代谢活性,在多次传代后未发生这些代谢活性、生产性能以及耐药性的改变,具有很好的安全性。
在乳制品生产中的应用研究表明,分别应用LA-SY02和BL-SY31制备的嗜酸乳杆菌酸奶和双歧杆菌奶粉,在保质期内益生菌活菌数完全达到了国标中规定的健康值指标(10,6>cfu/m1)。
本研究为开发降低胆固醇、治疗和预防因肠道致病菌引起的疾病、预防和辅助治疗因幽门螺杆引起的胃炎等疗效乳制品提供了菌种资源和应用基础;并建立益生菌鉴定、筛选及功能性试验的有效方法体系,为我国益生菌新菌种的开发和功能性研究奠定了基础。