蚕豆叶片中电压门控氯离子通道基因的克隆和序列分析

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自从在蚕豆保卫细胞膜上发现存在离子通道以来,对植物细胞离子通道的认识迅速深入,已发现在植物细胞膜和内膜系统上存在K+通道、Ca2+通道、Cl-通道及苹果酸通道等多种离子通道类型,并对其特征、生理功能、调节及分子生物学等进行了一些研究。作为重要的阴离子通道之一,氯离子通道(Chloride Channel,CLCs)一般被认为与细胞膨压及渗透调节、离子稳态、胞内pH、气孔运动、营养物质运输、金属耐性、信号识别与转导等诸多功能有关。但是国内外对在植物中氯离子通道的研究起步较晚。本研究通过对GenBank中不同物种CLC基因进行同源性分析,利用ClustalX 1.83软件进行蛋白全序列多重比对,寻找完全保守的氨基酸区域,再用Primer5.0软件设计出特异性引物,采用RT-PCR方法从蚕豆叶片中克隆到一个824bp大小的cDNA序列,BLAST分析证实该基因片段属电压门控型氯离子通道基因(CLC)家族。再根据获得的片段设计3’RACE巢式引物,采用RACE技术从蚕豆中克隆到1587bp大小的氯离子通道cDNA序列,其中含有一个901bp大小的完整的开放阅读框,计算的理论分子量为32445.3Da,推测其分子式为C1478H2361N373O407S18,共含有带负电的氨基酸(Asp+Glu)20个,带正电的氨基酸(Arg+Lys)20个,蛋白的理论等电点为7.19。将扩增的基因编码的CLC命名为VfCLC(Vicia faba voltage-gated chloride channel),同源性分析表明该蛋白属于电压门控型氯离子(CLC)通道家族,且与大豆氯离子通道GmCLC同源性最高,为87.3%,与水稻日本晴氯离子通道同源性最低,为52.8%。蛋白疏水性分析表明蛋白N-端具有疏水性,C-端具有亲水性,整体表现为疏水性较强,疏水性最大值为3.156,最小值为-2.189。信号肽分析表明,在31和32位氨基酸之间很可能具有一个信号肽的切割位点。跨膜结构预测显示该蛋白存在四个跨膜螺旋,是一种跨膜蛋白。
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