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沙门菌引起的食源性疾病,具有重要的公共卫生学意义。家禽是沙门菌的主要宿主之一,因此,加强家禽沙门菌病的防控研究,不仅能保证家禽的生产性能,而且能够从源头减少人因摄入沙门菌而导致的疾病。近年来,利用基因工程技术,将病原菌相关基因敲除,构建新型减毒沙门菌作为疫苗的研究备受关注。新型减毒活疫苗具有免疫力坚实、免疫期长等特点,在预防控制沙门菌的感染方面具有明显优势。本研究通过λRed重组系统和自杀性质粒介导同源重组的方法,分别将肠炎沙门菌C50041株毒力相关基因spiC和代谢相关基因crp敲除,构建相应的单基因和双基因缺失突变菌,并评价了其生物学特性,探索了这些突变株作为减毒活疫苗的可行性。1肠炎沙门菌C50041crp、spiC基因缺失株构建与鉴定以肠炎沙门菌C50041基因组为模板,PCR扩增出crp基因上游925bp DNA序列,以及crp基因下游936bp DNA序列。将上游片段、Cm抗性基因片段及下游片段连接,成功构建重组质粒pMD-Δcrp/Cm。以重组质粒为模板,扩增打靶片段,其中间为Cm抗性基因,为两端crp基因同源臂。在λRed重组系统协助下,将野生型C50041的crp基因敲除,在Cm抗性平板上筛选阳性克隆。电转化编码FLP重组酶的温度敏感型质粒pCP20,转入上述筛选获得的阳性克隆中,以去除Cm抗性基因。PCR和测序鉴定结果表明,crp基因缺失株C50041Δcrp构建成功。通过重组自杀质粒pGMB151-ΔspiC/Km介导的同源重组,进一步敲除肠炎沙门菌C50041和C50041Δcrp突变株的spiC基因,成功构建C50041ΔspiC和双缺失株C50041ΔcrpΔspiC/Km。对3株缺失菌的生化特性、生长特性以及毒力等的鉴定结果表明,spiC基因的缺失对C50041的生化特性与生长特性无显著影响；但crp基因缺失后,C50041对多种糖类物质的代谢情况发生改变,且生长速度显著下降。细菌C50041ΔspiC的LD50约为2.87×106CFU,C50041Δcrp的LD50约为3.89×106CFU, C50041ΔcrpΔspiC/Km的LD50约为5.36×106CFU,3个缺失株之间差别不显著,但与C50041野生株LD50(约为3.11×103CFU)相比较而言,升高了约1,000倍左右。2肠炎沙门菌C50041缺失株免疫生物学特性研究选取小鼠巨噬细胞系RAW264.7为模型进行细胞侵袭实验,结果显示,与野生株相比,3株突变菌对RAW264.7细胞的黏附力明显降低,但3株突变菌之间差异不显著(p>0.05)；3株突变菌对RAW264.7细胞的侵袭力明显降低,C50041ΔcrpAspiC/Km和C50041Δcrp与C50041ΔspiC缺失株之间存在极显著差异(p<0.01),C50041ΔcrpΔspiC/Km与C50041Δcrp缺失株之间存在显著差异(p<0.05)。将3株缺失菌和野生菌以肌肉注射方式接种1日龄雏鸡,在肝脏,各缺失株在第10天均检测不到；在脾脏,以双缺失菌C50041ΔcrpΔspiC/Km最先被清除, C50041Δcrp缺失株其次,C50041ΔspiC缺失株持续时间最久；而野生型C50041在接种后第6天全部死亡。利用间接ELISA检测血清中IgG抗体,结果显示,3个突变菌免疫后第1周均可以检测到IgG抗体,免疫后第2周达到高峰,此后抗体水平均略有下降。小肠黏膜抗体sIgA的检测结果显示,C50041ΔspiC免疫组在免疫后第2周可以检测至sIgA抗体,而C50041Δcrp和C50041ΔcrpΔspiC/Km免疫组在第3周方可检测到。将3株缺失菌以肌肉注射方式免疫3日龄雏鸡,同时设立PBS对照组,免疫后第8天,以2.1×109CFU的肠炎沙门菌野生株攻毒,粪便中沙门菌含量结果显示,3个免疫组与PBS组之间存在极显著差异(p<0.01)；肝脏、脾脏中野生菌带菌量检测结果显示,3个免疫组与PBS组相比存在极显著差异(p<0.01),且PBS组肝脏、脾脏中野生菌持续时间更久。