目的:骨关节炎（OA）是一种慢性关节疾病,可导致进行性软骨破坏和随后的关节功能障碍。多年来,多位学者致力于研究骨关节炎形成的病因及机制,病因可能与代谢、遗传、局部因素等有关,病理生理方面,炎症因子如白细胞介素、肿瘤坏死因子及一些炎症通路被证明在骨关节炎的发生发展中起到了重要作用。但是,目前还没有彻底治愈这种疾病的方法,保守治疗只能延缓其进展;而膝关节置换术虽可以去除病变的关节组织,但需关节软骨被破坏到一定程度才能达到手术标准,这一过程可能十几甚至几十年,患者往往忍受长时间的病痛和心理折磨。且手术花费高、术后疼痛剧烈、需较长时间的恢复和功能锻炼,患者承受巨大的物质和精神压力。因此,找到有效减轻骨关节炎发生时炎症反应、减少甚至逆转软骨破坏的方法,成为很多学者努力的目标。经证实,在不同炎症性疾病发生时,内源性硫化氢（H₂S）在生物体内发挥着抗氧化和抗炎特性,机制可能为H₂S可以抑制淋巴细胞和免疫细胞产生的促炎介质。H₂S作为炎症调节剂时,对免疫细胞的促炎和抗炎作用取决于其浓度,生理浓度的H₂S可以产生较好的抗炎作用,而高浓度的H₂S则可能加重炎症的进展。研究表明,NF-κB通路是其发挥抗炎作用时的关键靶点之一。过去的一些年中,人们研究了H₂S在生物体内面临炎症反应、再灌注损伤等病理状态时时,对生物体的影响,也包括H₂S对关节炎症的影响:低浓度时,H₂S对多组织和不同细胞有抗炎作用,对关节炎亦有抗炎作用,而高浓度H₂S则加重炎症反应。因此,低浓度硫化氢可以有效保护膝关节炎关节软骨,减轻炎症反应对软骨的破坏。以往用于细胞及动物研究时,多用硫氢化钠（NaSH）来作为H₂S的释放剂,但是NaSH释放H₂S时极度不稳定,瞬时挥发大量H₂S,然后极速下降。因此,不能很好地模拟生物体内H₂S缓慢、低量而持续的释放过程及浓度变化,且对操作人员有毒性。因此,我们找到了一种新的H₂S缓释剂:GYY4137,它由Moore在2008年合成,可以在动物体或溶液中缓慢释放,很好地模拟动物体内H₂S的浓度及变化情况。GYY4137,别名对-（4-甲氧基苯基）-P-4-吗啉基-二硫代磷酸,分子结构如下图。是一种H₂S缓释剂释放剂,生成H₂S的速率为1lm/hr,对神经调节、高血压、炎症和血管张力具有多重作用,被用于研究H₂S的多种生物效应。多项研究表明,GYY4137已在动物实验中其他方面得以安全应用,例如,在内毒素休克小鼠模型中,被证明有抗炎作用,能抑制原发性人气道平滑肌细胞IL-8的分泌和细胞增殖,并在脓毒症期间刺激大鼠血浆中抗炎趋化因子IL-10的合成。但其在骨关节炎软骨保护方面的应用尚未见报道。笔者就GYY4137是否也对骨关节炎有保护作用做了研究。在本文中,研究GYY4137对完全弗式佐剂诱导的大鼠骨关节炎软骨的破坏的影响,及血清炎症因子表达的影响,也研究了其对白细胞介素1β（IL-1β）诱导的软骨炎症细胞中MMP-13、p-P65/P65蛋白的表达量,探讨其在NF-κB信号通路中的影响,本研究的完成,可以找到更适合用于H₂S研究的实验药物,证实GYY4137可对大鼠膝关节炎及炎性软骨细胞有保护作用,打开GYY4137用于骨关节炎研究的空白。方法:一、GYY4317对完全弗式佐剂诱导的大鼠膝关节炎的软骨保护及其炎症因子的影响。以完全弗式佐剂（CAF）于大鼠右后肢膝关节进行诱导,建立大鼠的关节炎模型,GYY4137治疗组在造模期间给予GYY4137干预。造模成功后取大鼠腹主动脉血、收集大鼠膝关节组织,进行后续指标的测定。以SD大鼠为实验动物,分为三组,每组20只:空白组、CAF诱导组、GYY4137治疗组。空白组注射等量生理盐水,CAF诱导组在大鼠右后肢膝关节注射CAF进行造模,GYY4137治疗组在大鼠右后肢膝关节注射CAF前1h、造模后6h、18h注射0.1mLGYY4137,分别相隔7天注射,共处理养育4周。1.通过对大鼠关节直径的测量及对比,对比大鼠膝关节肿胀程度。2.观察大鼠膝关节软骨层破坏程度。3.以酶联免疫吸附法（ELISA）检测大鼠腹主动脉血清相关炎症因子:肿瘤坏死因子（TNF-α）和白细胞介素1β（IL-1β）的表达量。4.Case Viewer软件测量计算及对比各实验组软骨层厚度。5.使用苏木精-伊红染色法（HE染色）和番红-固绿染色法观察大鼠膝关节软骨层厚度、炎细胞浸润程度、软骨细胞破坏情况;二:GYY4137对IL-1β诱导的软骨细胞保护作用实验方案经青岛大学附属医院伦理委员会批准,批准号为AHQU-MAL2019037。培育人软骨细胞,在培养基中加入不同浓度GYY4137培养,进行后续指标的测定。将培育的人软骨细胞分为三组:空白组,IL-1β诱导组,GYY4137治疗组。培养基为含10%胎牛血清及1%双抗的DMEM,软骨细胞空白组使用普通培养基,不予特殊处理,IL-1β诱导组加入含IL-1β（1ng/ml）的培养基进行诱导炎症反应,GYY4137治疗组给予IL-1β（1ng/ml）诱导后,分别给予含200、500、1000mmol/L GYY4137的培养基处理。1.利用CCK-8法测定不同浓度GYY4137的培养基中,软骨细胞的存活率和抑制率。2.蛋白免疫印迹法（Western blot）测定软骨细胞内NF-κB65、P-NF-κB65,MMP-13蛋白的表达。结果:一.GYY4317对完全弗式佐剂诱导的大鼠膝关节炎软骨有保护作用,对OA炎症反应有较好的抑制作用。1:相比于CAF诱导组,GYY4137治疗组的大鼠膝关节直径均值明显减小。2:膝关节染色结果:相较于空白组,CAF诱导组和GYY4137治疗组软骨层厚度均值下降,而相较于CAF诱导组,GYY4137治疗组软骨层厚度均值升高。3:染色结果:CAF诱导组HE染色软骨细胞蓝染减少消失,细胞排列紊乱,炎症细胞浸润较多,番红-固绿染色软骨细胞淡粉色染色变浅消失,骨小梁蓝绿染色减少,而GYY4137治疗组HE染色软骨细胞蓝染轻度减少,细胞肥大,炎症细胞浸润减少,番红-固绿染色蓝绿色相对较浅,但仍可见软骨与骨组织分界。。3:ELISA法检测结果:CAF诱导组及GYY4137治疗组的TNF-α、IL-1β表达量均高于空白组。二:GYY4137对IL-1β诱导的软骨细胞保护作用1:CCK-8实验表明,软骨细胞在处理24h后,存活率无差异。2:免疫蛋白印迹结果:与空白组相比,CAF诱导组MMP-13、NF-κBp65、p-NF-κB P65蛋白水平明显升高。与CAF诱导组相比,GYY4137治疗组蛋白水平则显著降低,且不同浓度GYY4137对结果亦有影响,较低浓度的GYY4137可以更有效减低蛋白的表达。结论:GYY4137可以有效减轻大鼠骨关节炎时膝关节的肿胀及软骨层破坏,抑制体内的炎性因子生成。GYY4137可以通过NF-κB通路参与MMP-13、NF-κBp65、p-NF-κB P65表达的调控、从而减少软骨基质的破坏,有效保护膝关节软骨。