论文部分内容阅读
目的:研究长链非编码RNA肌动蛋白纤维相关蛋白1反义RNA1（AFAP1-AS1）在喉癌（LC）组织中的表达情况,探讨AFAP1-AS1对人喉癌细胞系的增殖、侵袭、迁移、凋亡等细胞功能的影响。方法:按照纳入和排除标准将2020年6月-2020年12月在南昌大学第二附属医院耳鼻咽喉头颈外科接受喉癌（LC）手术的29例喉癌（LC）患者纳入。收取喉癌组织标本及癌旁正常组织标本,采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测喉癌组织及癌旁正常组织中AFAP1-AS1的表达,并结合患者的临床特征及病理学特征进行相关统计学分析。构建低表达AFAP1-AS1质粒,并与空白质粒分别转染至人喉癌细胞系TU212细胞,实验分为三组,即空白对照组、空载组及实验组（AFAP1-AS1低表达组）。转染完成后采用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）检测三组细胞中AFAP1-AS1的表达量,验证转染效率,AFAP1-AS1表达量下调大于50%以上表明转染成功。分别利用细胞计数实验（CCK8）、平板克隆形成实验、Edu细胞染色实验检测三组TU212细胞系的细胞生长增殖能力;Transwell小室、划痕实验分别用于检测三组TU212细胞的侵袭及迁移能力;流式细胞术分别验证三组TU212细胞凋亡功能。统计学方法:选择χ2检验或Fisher精确检验在各个实验数据中的相关计数信息之间比较,如性别,年龄等。计量分析数据除特别需要加以明确注明外均将采用（x±s）中的公式函数来精确表示,在对计量数据模型进行分析处理的工作过程中,首先需要对每组中的计量分析数据都分别进行正态数据分布参数检验和方差齐性参数分析,多组间采用单因素方差分析,两组间的数据比较可以采用两样本的t检验。以P<0.05表示差异具有统计学意义。结果:1.利用实时荧光定量聚合酶链反应（RT-PCR）,我们发现相对于癌旁正常组织,喉癌组织中AFAP1-AS1的相对表达量明显上调,[（3.051±4.523）vs（1.±0.004）,P<0.05],差异有统计学意义。以喉癌组织中的AFAP1-AS1相对表达量的平均值3.051为基础将其细化分为AFAP1-AS1高表达组和AFAP1-AS1低表达组,同时结合患者的临床病理特征（如T分期、临床分期等）进行统计学分析。2.构建低表达AFAP1-AS1质粒,并转染至3组TU212细胞后,利用q RT-RCR测定AFAP1-AS1的表达量,与空白对照组对比,转染空载组的细胞系中AFAP1-AS1的△CT值无明显增高（P>0.05）,差异无统计学意义,与空白对照组分别对比,AFAP1-AS1 siRNA3组细胞系中AFAP1-AS1的△CT值更高（P值分别<0.05、<0.05、<0.05）,差异具有统计学意义;与转染空载组分别对比AFAP1-AS1 siRNA3组细胞系中AFAP1-AS1的△CT值更高（P值分别<0.05,<0.05,<0.05）,差异有统计学意义,表明AFAP1-AS1低表达质粒转染成功,并从AFAP1-AS1 siRNA3组中选择AFAP1-AS1低表达最好的一组即AFAP1-AS1 siRNA-2组继续进行下一步实验。3.低表达AFAP1-AS1抑制TU212细胞的增殖,细胞计数实验（cell counting kit-8,CCK-8）提示,相对空白对照组,转染空载组细胞生长能力无明显下降（P>0.05）,差异无统计学意义,然而AFAP1-AS1 siRNA组,细胞生长能力明显减退（P<0.05）,差异有统计学意义;Edu细胞染色实验提示,相对正常对照组,转染空载组细胞增殖能力无下降趋势（P>0.05）,差异无统计学意义,然而AFAP1-AS1 siRNA组,细胞增殖能力明显减弱（P<0.01）,差异有统计学意义;平板克隆实验提示,相对正常对照组,转染空载组细胞菌落数量无减少趋势（P>0.05）,差异无统计学意义,然而AFAP1-AS1 siRNA组,细胞菌落数量明显减少（P<0.01）,差异有统计学意义。4、低表达AFAP1-AS1抑制TU212细胞的侵袭,Transwell小室侵袭实验提示,相对空白对照组,转染空载组细胞侵袭能力无下降趋势（P>0.05）,差异无统计学意义,然而AFAP1-AS1 siRNA组,细胞侵袭能力明显受到抑制（P<0.05）,差异有统计学意义。5、低表达AFAP1-AS1抑制TU212细胞的迁移,划痕实验提示,24小时后相对空白对照组,转染空载组空白面积无增大趋势（P>0.05）,差异无统计学意义,然而AFAP1-AS1 siRNA组,空白面积明显增大（P<0.05）,差异有统计学意义,表明细胞迁移能力明显被抑制。6、低表达AFAP1-AS1促进TU212细胞的凋亡,流式细胞术提示,相对空白对照组,转染空载组细胞凋亡率无增加趋势（P>0.05）,差异无统计学意义,然而AFAP1-AS1 siRNA组,细胞凋亡率明显提高（P<0.05）,差异具有统计学意义。结论:Ln RNA AFAP1-AS1在LC组织中高表达,并与LC的临床病理特征相关。低表达AFAP1-AS1可抑制TU212细胞的增殖、侵袭、迁移,诱导其凋亡。