宫颈癌主要是由人乳头瘤病毒（human papillomavirus,HPV）引起的、致死率最高的女性恶性肿瘤之一,我国每年约13万女性被确诊为宫颈癌,占世界宫颈癌发病人数的1/4。传统治疗手段（外科手术、放疗以及化疗等）仍是宫颈癌治疗的首选方案,但对于不理想的进展期、转移以及复发性宫颈癌治疗效果不佳。近年来,随着分子诊断技术的发展,宫颈癌组织中HPV病毒的检出率高达99%,我国西南地区宫颈癌患者16型和18型HPV的检出率分别是73.8%和16.4%,并且有研究表明针对HPV E7的特异性T细胞在HPV清除和改善HPV引起的病变中发挥重要作用。在免疫系统中树突状细胞（Dendritic cells,DCs）是功能最强的抗原呈递细胞,是T细胞免疫应答的关键介导者,DC细胞在体内发现、摄取抗原,经过加工处理后呈递给T细胞进而激活T细胞。为了获得HPV16 E7特异性T细胞,本课题利用HPV基因制作了宫颈癌相关的抗原,然后通过DC细胞吞噬处理该抗原之后激活T细胞,从而获得HPV16 E7特异性细胞毒性T淋巴细胞,最后通过体外实验验证了此T细胞的杀伤能力。主要研究结果如下:1、宫颈癌相关抗原的合成有研究表明纤连蛋白额外结构域（EDA）能够把抗原靶向DC细胞并通过DC细胞表面TLR4受体诱导DC细胞分化成熟。为了提高DC细胞吞噬和呈递抗原的能力,本研究设计了EDA和E7的融合蛋白,同时为了降低HPV E7蛋白诱导癌变的能力,删除了HPV 16 E7蛋白与宿主PRb蛋白结合的区域,使HPV 16 E7第1-29个氨基酸和第43-98个氨基酸分别连接到EDA蛋白的N端和C端,即E7（1-29）aa+EDA+E7（43-98）aa简称为EDA+E7,同时设置对照组EDA和E7（1-29）aa+E7（43-98）aa简称为E7。通过大肠杆菌E.coli BL21（DE3）对目的基因进行表达,利用亲和层析对重组蛋白进行纯化,然后通过SDS-PAGE检测重组蛋白的纯度,最后通过蛋白浓缩和内毒素去除操作使重组蛋白进一步满足实验需求。2、DC细胞获得及表型研究首先通过Western Blot验证了重组蛋白EDA+E7具有通过TOLL受体激活NF-κB信号通路的能力,证明通过原核系统表达的重组蛋白具有正确的空间结构和相应的生物学功能。然后通过荧光显微镜和流式细胞术检测重组蛋白被DC细胞吞噬的情况,结果显示DC细胞摄取重组蛋白EDA+E7的能力强于对照组EDA和E7,说明HPV E7蛋白融合EDA之后提高了DC细胞对其的吞噬能力。不同浓度的重组蛋白EDA+E7处理DC细胞,结果显示,在一定浓度范围内,DC细胞表型成熟相关分子的表达水平与重组蛋白浓度成正比,且当重组蛋白EDA+E7浓度达到800n M时这些分子表达水平达到最高。DC细胞表型和细胞因子分泌结果显示,重组蛋白EDA+E7可以诱导DC细胞分化达到表型成熟,并且重组蛋白EDA+E7配合TOLL受体激动剂可以促进DC细胞分泌细胞因子IL-12和TNF-α,使之达到功能成熟。3、HPV E7特异性T细胞制备及其杀伤功能研究通过多色流式法检测不同的TOLL受体激动剂诱导成熟后的DC细胞激活T细胞的能力。以CD8 T细胞为例,只加入重组蛋白EDA+E7的DC细胞激活CD8T细胞的比例仅为3.43%,而加入TOLL受体激动剂R848之后的DC细胞激活CD8T细胞的比例达到了10%,同时有些TOLL受体激动剂导致DC细胞活化T细胞的能力下降,CD4 T细胞中也存在类似的现象。我们认为TOLL受体能够有效的增强DC细胞激活T细胞的能力,且不同的TOLL受体激动剂之间存在拮抗作用,导致有些TOLL受体激动剂的使用降低了DC细胞激活T细胞的能力。T细胞对宫颈癌细胞的杀伤结果显示,经重组蛋白EDA+E7激活后的T细胞杀伤能力明显强于无关抗原激活后的T细胞杀伤能力,并且在一定的范围内T细胞的杀伤能力随着效靶比的增大而增大,随着杀伤时间的延长而增强。综上所述,本研究制作了宫颈癌相关的重组蛋白EDA+E7,对比直接使用HPV E7蛋白处理DC细胞,这种融合蛋白能够更好的被DC细胞识别和吞噬。通过重组蛋白EDA+E7和TOLL受体激动剂诱导成熟后的DC细胞可以在体外特异性激活T细胞,并且这种T细胞有较强的特异性杀伤宫颈癌细胞的能力。本研究的开展为研究宫颈癌的靶向治疗和免疫细胞的体外培养提供了相应的理论依据和经验。