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目的在课题组前期实验的基础上,观察爱康方对人肺腺癌A549、小鼠Lewis细胞内Bad、Caspase-9、Survivin、m TOR蛋白及基因表达的影响,更深层次探讨爱康方促进肺癌细胞凋亡及与环磷酰胺起到协同作用可能的分子机制。方法选用纯系SPF级雄性大鼠40只,体重在220±20克范围之间,用随机分组的方法,分为空白对照组(生理盐水灌胃)、环磷酰胺组(环磷酰胺腹腔注射)、爱康方组(爱康方灌胃)及爱康方联合环磷酰胺组(爱康方灌胃联合环磷酰胺腹腔注射),每组各10只。大鼠连续灌胃5天之后进行心脏取血,血清分离并灭活,置于-80℃冰箱保存。购买A549、Lewis细胞进行培养,根据所加的不同含药血清对应分组:空白对照组、环磷酰胺组、爱康方组及爱康方联合环磷酰胺组,分别培养48h和72h,收集细胞用于检测。分别采用免疫荧光法和蛋白免疫印迹法(Western Blot)法检测Bad、Caspase-9、Survivin、m TOR蛋白表达水平;采用实时荧光定量PCR技术(Real Time Quantitative PCR,简称RT-PCR)检测样本中Bad、Caspase-9、Survivin、m TOR目的基因m RNA转录水平的变化情况,以明确爱康方促进肺癌细胞凋亡及与环磷酰胺起到协同作用可能的分子机制。结果1.爱康方及爱康方协同环磷酰胺对A549细胞中Bad、Caspase-9表达的影响:免疫荧光法和Western blot法检测发现Bad、Caspase-9蛋白的表达水平随着药效的增加而上升;其中空白对照组表达水平最低,爱康方联合环磷酰胺组表达水平最高;与空白对照组相比,爱康方组、环磷酰胺组、爱康方联合环磷酰胺组蛋白表达水平均显著上升,差异具有统计学意义(P<0.01);与环磷酰胺组相比,爱康方联合环磷酰胺组蛋白表达水平升高更明显,差异具有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR法检测结果显示,Bad及Caspase-9的m RNA表达水平均随着药效的增加而上升;表达趋势同Western bl-oting法结果。2.爱康方及爱康方协同环磷酰胺对A549细胞中Survivin、m TOR表达的影响:免疫荧光法和Western bloting法检测发现Survivin、m TOR蛋白的表达水平随着药效的增加而降低;其中空白对照组表达水平最高,爱康方联合环磷酰胺组表达水平最低;与空白对照组相比,爱康方组、环磷酰胺组、爱康方联合环磷酰胺组蛋白表达水平均显著下降,差异具有统计学意义(P<0.01);与环磷酰胺组相比,爱康方联合环磷酰胺组蛋白表达水平降低更明显,差异具有统计学意义(P<0.05)。RT-PCR法检测结果显示,Surv ivin及m TOR的m RNA表达水平均随着药效的增加而下降;表达趋势同Western blot法结果。3.爱康方对Lewis细胞中Bad、Caspase-9、Survivin、m TOR蛋白及基因表达的影响结果同A549细胞。结论1.爱康方以及爱康方协同环磷酰胺能够使人肺腺癌A549、小鼠Lewis细胞内Bad、Caspase-9蛋白及基因表达水平上调,Survivin、m TOR蛋白及基因表达水平下调。2.爱康方能够促进人肺腺癌A549、小鼠Lewis细胞凋亡,并与环磷酰胺起到协同作用,其机制可能是:(1)与调节凋亡相关蛋白Bad、Caspase-9、Survivin的表达相关;(2)通过下调m TOR蛋白的表达,抑制PI3K/AKT-m TOR信号通路在肺癌细胞中的异常活化,从而促进细胞凋亡,同时减轻环磷酰胺的耐药水平,且凋亡程度与时间相关。